Способ получения @ -галактозидазы

 

„„952111

Союз Соввтскик

Социапистмчвскик

Рвспубякк (61) Дополнительный к патенту (22) Заявлено 05. 02. 79 (21) 2724401/28-13 (23) Приоритет — (32) 06.02.78 (31) 12102/78 (33) Япония

3 (51) М. Кл.

С 12 N 9/38

Гесудлрстееллые комитет

Опубликовано 15. 08. 82 Бюллетень,% 30

Дата опубликования описания 18.08.82 яе делам лэабретеннй и вткрытий (з) j1,K 577. .15(088,8) (72) Авторы изобретения

Иностранцы

Тан Нива, Рейсуке Кобаяси и Киеси Такита (Япония) Иностранная фирма

"Кумиаи Кемикал Индастри К.О., ЛТД" (Япония) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 1 -ГАЛАКТОЗИДАЗЫ

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к способам получения фермента P-галактозидазы.

Известен способ получения Р-галактозидазы путем культивирования штамма,- продуцента Asperg i 11us oryzae FERM-F-1680 на питательной среде, содержащей отруби в качестве источника азота и другие питательные компоненты с последующим выделением и очисткой фермента. Полученный препарат гидролиэует лактоэу, 0-ип-нитрофенил-Р-0-галактопираноэид и фенил-Рэ-0-галактопиранозид (1).

Активность фермента невысока.

Наиболее близким к предлагаемому является способ получения 1э-галактоэидазы, предусматривающий культивирование продуцирующего его микроорганизма штамма рода Peni ci1 1 ium на питательной среде, содержащей ассими:лируемый углерод и источники азота совместно или без минеральных солей в аэробных условиях при 75-45 l; и рН среды 3,5-8 в течение 16-120 ч с последующим выделением фермента иэ культуральной жидкости экстракцией растворителем, осаждением, очисткой, фильтрацией и т.д. (2).

Полученный фермент обладает достаточно высокой активностью, но не является термически стабильным и должен храниться на холоду.

Цель изобретения — повышение стойкости и а кти вности целе во го продукта.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения Р-галактоэидазы, предусматривающему культивирование продуцирующего его микроорганизма штамма иэ рода Penicil1ium на питательной среде, содержащей .ассимилируемый углерод и источники азота совместно или без минеральных солей, в аэробных условиях с последующим выделением фермента из культуральной жидкости, в качестве продуцмрую952111 4

20 щего микроорганизма используют штамм

Penici1lium multicolor KU-0-312, идентифицированный как FERN-$4375 или ATCC 20539, а в качестве источника азота - отруби.

Сущность способа состоит в том, что для получения фермента В-галактозидазы используют штамм Penicillium

multi î1îã KU-0-312.

Этот штамм депонирован в японс- 1О ком депозаторном институте по исследованию ферментации Агентства индустриальной науки и технологии Японии

Киаго Тиба Сити 25 января под номером FERN-P4375 а также в, Американской 1з

Коллекции типовых культур под номером ATCC 20539.

Морфологические, свойства, присущие штамму Penicillium multicolor

К0-0-312.

Макроскопические наблюдения (после инкубации при 25 С в течение

10 дней на агаровой среде Чапека)..

При росте Peniс111ium multicolor образуются колонии диаметром 30 - 2s

40 мм. Поверхность радиально морщинистая с плотным бархатистым слоем конидиумов от глубоко сине-зеленого до серовато-зеленого цвета, периферия на ширину 1-2 мм от оранжевого зв до желтого цвета. Обратная схрона от желтого до коричневого цвета.

Микроскопические наблюдения (после инкубации при 25 С в течение

10 дней на агаровой среде Чапека).

Пучки мономутовочные.

Конидофоры прямые и вертикальные, без разветвления, шириной 2-3 мк с расширением к концу.

Стеригма: от 6 до 14 стеригм в пачке.

Конидиум сферический или овальной формы диаметром 2-3 мк.

Поверхность гладкая.При использовании предлагаемого способа штамм Penicillium multiñîlor может культивироваться в жидкой или в твердой питательной среде при при" менении известных методов в анаэробных условиях. Культуральная среда содержит одно или более природное питательное вещество, а именно пшеничные отруби, рисовые отруби, обезжиренную соевую муку> муку хлопковых, семян в качестве основных компонен>

5S тов, Культуральная среда может также содержать лактозу, крахмал, глюкозу, арабинозу и ксилозу в качестве источи> к;> углерода и сульфат аммония, нитрат натрия, пептон, солодовый и дрожжевой экстракт в качестве источника азота. В куль тураль ную среду могут быть включены неорганические соли, например фосфаты и соли магния и кальция. Обычно целесообразно проводить культивацию Penicillium multi— о

color при 10-35 С, предпочтительнее

25-33 С, в среде с рН 4-9, предпочтительнее 5-7, в течение 1-8 дней, хотя условия культивации могут изменяться в зависимости от способа культивации . Продуцирование новой /3 - галактозидазы согласно предлагаемому способу достигает максимума после

2-6 дней инкубации.

При культивировании в твердой среде новая Р -галактозидаза может получаться с активностью около 1000 едиединиц на 1 г твердой культуральной среды

При культивировании в жидкой среде можно получить фермент с активностью около 150 единиц на 1 мл жидкой среды.

Для извлечения 1-галактозидазы согласно изобретению из культуральной среды Penicillium multicolor, где образуется и накапливается фермент, жидкую культуральную среду освобождают от твердых веществ фильтрацией или центрифугированием и полученный фильтрат затем концентрируют отгонкой под уменьшенным давлением или пропускают через диалитическую мембрану и затем подвергают процессу высаливания сульфатом аммония или процессу осаждения ацетоном и/или этанолом для получения неочищенного порошка f3-галактозидазы. Твердую культуральную среду обрабатывают водой (для экстракции фермента) и полученный водный экстракт обрабатывают таким же образом как упомянутый фильтрат., Сама культуральная среда, фильтрат и водный экстракт могут использоваться в качестве неочищенной

Р-галактозидазы. Для дальнейшей очистки неочищенная Р-галактозидаза может быть обработана по известному методу очистки энзимов, например методом ионообмена, гелевой фильтрации, диализа, адсорбции и методом осаждения протеина. Когда концентрированный фильтрат или водный экстракт, содержащий Р -галактозидазу, смешивают с ацетоном до содержания его 30-40 вес.3, почти вся Р-галактозидаза может быть осаждена в виде порошка, который после сушки обнару95211

100

100

224

393

288

186

Около

100000

Около

120000

4-5

4,5

3,5-8

2 5 7

50

Менее

Менее

3,5-8,0

2,5-8,0

100

60 живает, например, высокую галактозидазную активность порядка 34,8 ед./мг.

Порошковая Р-гал актозидаза активностью 34,8 ед/мг обычно не требует дальнейшей очистки, если назначается орально не переносящим лактозы пациентам в виде порошка, гранул или таблеток в смеси с фармацевтически приемлемым носителем, например крахмалом, может быть растворена в моло- 10 ке и любом напитке, принимаемом пациентом.

Активность Р- галактозидазы оценивают по обычному методу испытания следующим образом. 15

Смешивают 1 мл субстратного раствора, содержащего 3,7 мг/мл о-нитрофенил- -0-галактопиранозида в воде, 2 мл 0,2 М забуференного раствора макильвана (рН 1,5) и, 1 мл раствора щ энзима, смесь нагревают при 37 С о

15 мин для вызывания энзиматической реакции. После этого реакционную

Субстрат (гликозиды) Лактоза о-Нитрифенил-)-0- галактониранозид и-Нитрофенил-P-0-галактониранозид

Молекулярный вес (по гелевому методу)

Оптимум рН

Активное рН (пределы, в которых активен энзим) Оптимум температуры, о С

Активная температура (пределы темо пературы, в которых активен энзим) > С

Стабильность при рН (предел рН, в котором энзим стабилен при стоянии в течение 24 ч при 4 С) Термическая стабильность (остаточная -галактозидазная активность после стояния 15 мин при рН 6), Ф, при температуре, С о

1 6 смесь смешивают с 1 мл водного 1 раствора карбоната натрия для остановки реакции . Для определения содержания образовавшегося о-нитрофенила реакционную смесь подвергают колориметрическому анализу при длине волны 420 мкм, используя эталонную кривую для колориметрического анализа о-нитрофенола. Когда энзим может давать 1 мкмоль о-нитрофенола в 1 мин, счйтается, что этот энзим имеет

1 единицу активности.

Для подтверждения преимуществ энэиматических свойств Р -галактозидазы, полученной согласно предлагаемому способу, их сравнивают со свойствами известной P — галактозидазы из

Penici11ium citrinum, которая является представительной для 3-галактозидазы продуцируемых другими видами

Penici11ium 2 . Результаты этого сравнения представлены в таблице..

Относительная активность, 8

Продолжение таблицы

952111

65

Почти не ингибитируется

Железо (Fe++)

Медь (Cu+ )

Ртуть (Hg ) Почти не ингибитируется

Почти не ингибитируется

Почти не ингибитируется

Почти не ингибитируется

Ингибитируется íà 20

6,41

5,37

87

71

82

64 вес.3 метанола вес.3 этанола содержащая 50 содержащая 40

Вода, Вода, 91

Вода, содержащая 40

Вода, содержащая 50 вес.3 ацетона

Ф вес.3 ацетона

Эффект металлических ионов при молярной концентрации 10

Изо-электрическая точка, определенная электрофорезом

Растворимость в водных органических растворителях, Ф

Вода, содержащая 40 вес.3 метанола

Вода, чодержащая 50 вес.3 этанола

Пример 1. Твердую культу--Э5 ральную среду, состоящую из 10 r пшеничных отрубей, 10 г обезжиренной соевой муки и 20 мл воды., загружают в 500 мл коническую колбу и сте- о 40 рилизуют при 120 С 15 мин в автоклаве и затем заражают косой культурой

Peni c i ilium mul t i color KU-0-132. 3араженную среду затем инкубируют в

0 стерильном воздухе при 28 С 4 дня

45 и затем смешивают с 200 мл водного экстракта Р-галактозидазы в водной

Фазе. Смесь отфильтровывают для удаления твердых веществ ° Полученный фильтрат, т.е. водный экстракт, об50 наруживает Р3 галактозидазную активность в 228 ед./мл.

П р и м e p 2. Жидкую культуральную среду (100 мл), содержащую Зь рисовых отрубей, 14 муки хлопковых семян, 0,253 кислого Фосфата калия и 0,15< фосфата калия (рН 6,2) загружают в 500 мл колбу и стерилизуют нагреванием в автоклаве. Стерилизованную среду заражают косой культурой Pen i c i 11 i um mu1 t i color KU-0-132 и культивируют с взбалтыванием при о

28 С 3 дня на взбалтывающем столе.

Инкубированную среду отфиль тровывают.

Полученный фильтрат обнаруживает

Р-галактозидазную активность в

140 ед, /мл.

Пример За. Твердую культуральную среду, состоящую из равномерной смеси 1,5 кг обезжиренной соевой муки, 1,5 кг муки хлопковых семян и 3 л воды, помещают в виде слоя в большой бак и стерилизуют нагреванием в автоклаве.

Стерилизованную среду заражают

150 r посевной культуры Peniñillium

multicolor KU-0"132, полученной инкубированием косой культуры этого микроорганизма в среде из отрубей (смесь пшеничных отрубей и воды в соотношении 1:1 по весу). Затем зараженную среду спокойно инкубируют при 28 С 5 дней и инкубированную сре952111

10

Формула изобретения

Составитель И

Техред М. Рейв

Редактор Л, Алексеенко

Заказ 5991/81

Тирам 505 Подпи сное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР пб делам изобретений и открытий

113035 Иосква, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

9 ду размельчают и набивают в цилиндрическую стеклянную колонку, через которую пропускают воду с верха колонки. Раствор экстракта (18 л), содержащий желаемый энзим, получают 5 как элюент внизу колонки, его центрифугируют для освобождения от мало— го количества твердых веществ, суспендированных в этом растворе. Полученный верхний слой раствора обнаруживает Р-галактозидазную активность в 347 ед./мл.

Пример 3в. Верхний слой раствора концентрируют до объема 4 л путем ультрафильтрования и затем к 15 нему добавляют по каплям 2,7 л ацетона при низкой температуре. Образовавшийся осадок удаляют фильтрованием, высушивают над уменьшенным давлением и получают 165 г порошка Pi-га- 2о лактозидазы, обнаруживающей высокую

P-ràëàêTo3èäà3Hóþ активность в .

34800 ед./г. Выход 92 .

Пример Зс. Порошок -галактозидазы (мощность 34800 ед./г), по- 25 лученный описанным путем, очищают да- лее следующим образом.

Порошок растворяют в забуференном

0,0 l M растворе ацетата при рН 4,5 и полученный раствор пропускают через зр колонку с СМ-целлюлозой для адсорбирования фермента. Затем колонку элюируют водными растворами хлористого натрия. Активные фракции элюата объединяют,диализуют с забуференным

0,01 И раствором фосфата при рН 7,0 и диализованный раствор фермента пропускают через колонку с ДЕАЕ-целлюлозой для адсорбции фермента. Эту колонку элюируют водными растворами хлористого натрия. Активные фракции элюата объединяют и пропускают че" рез колонку с гелевым фильтрационным агентом ("Сефадекс" фирмы фармация К, Швеция). Элюент, выходящий . 45 из колонки, собирают по фракциям и фракции, обнаруживающие галактозидазную активность на постоянном уровне, объединяют и концентрируют под уменьшенным давлением.

К полученному концентрированному раствору добавляют по каплям этанол при низкой температуре для осаждения желаемого фермента. Фермент отфильтровывают, высушивают под уменьшенным давлением и получают чистый порошок р-галактозидазы, обнаруживающий

1-галактозидазную активность в

170000 ед./г. Выход 504 °

Таким образом, ферментный препарат, полученный предлагаемым способом)обладает высокой активностью и термической стабильностью с остаточной активностью при 60 С (100 ), что позволяет хранить его при комнатной температуре в закрытой емкости при 45 С е течение 1 месяца.

Остаточная активность сохраняется на уровне 954 и более и при хранении при 45 С в течение 1 месяца на откры- . том воздухе при относительной влажности 50-704.

Способ полученияР -галактозидазы, предусматривающий культивирование продуцирующего его микроорганизма штамма рода Penicil1ium на питательной среде, содержащей ассимилируемый углерод и источники азота совместно или без минеральных солей, в аэробных условиях с последующим выделением фермента из культуральной жид-. кости, отли чающи йся тем, что, с целью повышения стойкости и активности целевого продукта, в качестве продуцирующего микроорганизма используют штамм Penicillium multicolor KU-0-312, идентифицированный как ГЕКИ-Р4375 или АТСС 20539, а в качестве источника азота - оТруби.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Заявка Японии М 52-27035 кл. С 12 D 13/10, опублик. 1977.

2. Заявка Японии И 50-66589, кл. С 12 О 13/10, опублик, 1976 (прототип).

Привалова ес Корректор М. Демчик