Способ получения ферментного препарата @ -галактозидазы

 

А.А.Селезнева, Г.А.Бабенко, Н.Н.Момот, О.С Столыпин, О.В.Кондратьева, Э.В.Васильева, Б.П.Духович, И.М.Рабинович, Г.С.Парр, Н.Г.Михайлова и И..М.Терешин ,I !

Всесоюзный научно-исследовательский технологический институт антибиотиков и ферментов медйцинского назначения (72) Авторы изобретения (73) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА

Р-ГАЛАКТОЗИДАЗЫ

Изобретение относится к технологии получения ферментного препарата

Р-галактозидазы. Препарат предназначен для лечения лактаэной недостаточности.

Известен способ получеж:я ферментного препарата (3-галактозидазы путем фильтрации культуральной жидкости гриба-продуцента Со rvu i à г i a юаес1иа1 i s

19 штамм 15, сорбции фермента из полученного нативного раствора на катионообменной смоле, в качестве которой обычно используют карбоксильный катионит КИТ в высокодисперсной фор15 ме, представляющий собой продукт сополимеризации метакриловой кислоты и триазина, с последующей десорбцией фермента цитратным буфером, ультрафильтрацией раствора через ацетатцеллюлозную мембрану и лиофильной сушкой. Конечный продукт обладает активностью 5000-6000 ед/г

Однако известный способ имеет недостаточно высокую активность целе.ного продукта.

Цель изобретения — повышение активности целевого продукта.

Указанная цель достигаетея способом получения ферментного препарата

Р-галактозидазы, который заключается в том, что культуральную жидкость гриба-продуцента Си rvu1 à r i а ihaequa"

1 is штамм .75 подвергают. выморажива-! нию при (-15) - (-18) С в течение

12-15 ч с последующим оттаиванием, затем ее подвергают фильтрации, полученной в результате фильтрации нативный раствор концентрируют перед сорбцией в 10 раз по объему путем ультрафильтрации с помощью мембраны PTHK

00005, после чего проводят сорбцию фермента из сконцентрированного нативного раствора на катионообменной смоле, в качестве которой используют полимер, представляющий собой продукт

8С 177 сополимеризации метакриловой кислоты и триаэина.

Предлагаемый способ позволяет увеличить активность целевого продукта в 2 раза.

Введение в технологический процесс стадии замораживания и оттаивания культуральной жидкости перед фильтрацией увеличивается скорость фильтрации в 1,5-2 раза, за счет увлечения слизистых полисахаридов продуцента разрушенными клетками мицелия. Кроме этого, иэ разрушенных клеток в раствор переходит эндогенная 1з-галактозидаэа. Активность раствора повышается в результате этого на 40%.

Так как введение стадии вымораживания-оттаивания культуральной жидкости позволяет освободить нативный раствор фермента от сопутствующих слизистых осадков полисахариднои природы, то возможно проводить концентрирование активности нативного раствора с помощью ультрафильтрации, что позволяет получить продукт бо лее высокого качества.

Таким образом, сочетание и указанная последовательность операций при проведении процесса в строго определенных условиях (рН, температура, ионная сила растворов, использование испита и мембраны заданной структуры) позволяет получить препарат высокого качества и чистоты, из которого можно приготовить фермент

35 медицинского назначения, Предлагаемый способ получения ферментного препарата P-ãàëàêòoçèäàзы состоит из следующих стадий:

1. Вымораживание культуральной жидкости при (-15) †(-18) С 12-15 ч, 40 оттаивание при комнатной температуре, 2. Фильтрация культуральной жидкости через фильтр с наполнителем (например: перлит, кизельгур, инфузорная земля в количестве 0,5 вес.%

Я к объему).

3. Концентрирование нативного раствора фермента на ультрафильтрационной установке "И1111роге" (США) на мембране типа РТНК 00005 при ком50 наткой температуре примерно в 8 10 раз.

4. Сорбция нативного раствора с рН 3,5 высокодисперсным катионитом КИТ.,И

5. Промывка смолы умягченной во, дой с рН 3,5-6,0 для десорбции бал" ластных белков.

6 4

6. Десорбция фермента со смолы

О, 2 M цитратным буферным раствором с рН 4,840,5.

7. Концентрирование элюата в 3 раза на ацетатцеллюлозной мембране

УАМ-300 с радиусом пор 100-150 А и последующими двумя диафильтрациями дистиллированной в одой к аждая в

10-кратном объеме к исходному.

8. Высушивание высококонцентрированных и обессоленных растворов фермента лиофильно известными способами.

Пример 1. Культуральную жидкость по окончании ферментации (активность 1,9 ед/мл, рН 4,9) сливают в емкость и замораживают при (-18)— (-20) С на 15 ч, оттаивают при комнатной температуре, фильтруют с наполнителем на рамном фильтр-прессе.

Выход на стадии фильтрации 80%. Натинный раствор с активностью

2,7 ед/мл в количестве 20 л концентрируют в 10 раз по объему на ультрафильтрационной установке фирмы

"Nil1iроге" на мембране типа РТНК

00005. Получают 2 л раствора с активностью 26 ед/мл, выход на стадии

96,3%. Полученный раствор поцкисляют 3 н. НС1 при перемешиваняи до рН 3,5, инактивации не наблюдается. (Ь-Г алактозидазу из раствора сорбируют высокодисперсной формой смолы

KNT (ТУ-6-09-10-456-75) (40-60 мкм в количестве 100 г) ца послойной ионообменной колонне, где смола (по 10 r) расположена 1 см — слоем па 10-и последовательно соединенных кольцах.

Смолу готовят путем последовательной обработки: 1 н. НСI умягченная вода, 1 í. Na0H в 2 н.-ном растворе

NaC1, 1 н.ацетатным буферным раствором с рН 3,5 с 1 í. NaC1. Скорость фильтрации раствора через смолу

30 мл/ч.см . Выход на стадии сорбции

85%. Затем для десорбции со смолы балластных белков проводят промывку умягченной водой с рН 3,5 и нейтральным рН (по 2 л) .

Десорбцию } -галактозидазы осуществляют 0,2 н. цитратным буферным

pacTBopoM pFI 4,8 со скоростью

1 О мл/ч сМ2, Собирают 5 фракций по

300 мл, в трех средних содержится

85% сорбированного фермента со средней активностью 39 ед/мл. Эти фракции концентрируют и деминерализуют с помощью ацетатцеллюлозной мембраны

УАМ-200 (ТУ-6-05-221-599-77) в ячейки orраниченного объема, получают

250 мл с активностью 135 ед/мл, т.е. выход на стадии 96Х. Лиофилизация . концентрата проходит с выходом по активности 75Х. Получают 2,12 г препарата с активностью 12 ед/мг. Выход конечного продукта от содержания в культуральной жидкости 38Х, Пример 2. Культуральную жидкость по окончании ферментации с активностью 2,2 ед/мл, рН 4,4 подвергают замораживанию. Замораживание повышает активность исходного раствора до 3,0 ед/мл. Полученный после фильтрации. культуральной жидкости (выход 80X) на рамном фильтр-прессе с 0,5Х перлита нативный раствор (25 л по объему) концентрируют на ультрафильтрационной установке "Ni!lipore".

Выход на стадии 98,5Х, т.е. получают 2,5 л с активностью 29,6 ед/мл.

1776 4

Сорбция подкисленного до рН 3,5 концентрированного нативного раствора проходит с выходом 82Х. После промывки смолы в колонне подкисленной и

s нHеeйHтTр а л ьbнHоoH и у мя гrч еeнHнHоoй в оoд оoй, проводят десорбцию. Получают 1,2 л элюата со средней активностью 42 ед/мл, выход составляет 83%. Элюат деминерализуют и концентрируют ультрафильтрацией

1Е до 360 мл, активность полученного, концентрата 133 ед/мл, выход на стадии 95Х.

После лиофилизации концентрата получают порошок в количестве 3,17 л с активностью 11 ед/Mr. Выход на стадии лиофилизации 73Х, общий выход конечного продукта от содержания в культуральной жидкости 37Х.

В табл. 1 приведены сравнительные

20 данные по очистке Р-галактозидазы известным и предлагаемым способами, в табл. 2 — характеристика технологического процесса.

89177Ü

1 ь л

Р Ъ

1 t 1

1 д

1 O

1Э

in O л с 1 б. ь л

С ) 1

Ы 0

Ф IC л

A Ф ж v .МО1

IQ .

Ж ! Э

Ц о а ж о

I

Ф е

Ch l

1

1 ь ь

Ю л

Ch Cti

Ю

Ch! 1 I о К т

1 н

Х К 6 I о ь

it! Р I

v 3 д 1

o o t ж !. К О аоэ1 а.

Ð -! ж

Ж Е 1 М

ecd1о ь

О! л ь а1 1

v о 1

Э 1

Ф о

М

g Ю а о

Ф3 О I о ж о

1

l о

1 а О

Ж сб

l g Р ж о

l Ф

& Жоо3

l М Сл у о

E и Р

grdO

dt (ttt ооЫ

Р,X m ао5

g3"

ЩЖф

П +

I ф

Р

Е о

I 1 мам о о у

1 ь

ОО ь ь о ь

CV ь ь

А Ж, E

v g

Р Р И о !. о ж е !

I/s

О ь ь ь ь. ь ь ь и ах

1 о

ld P

v а о оХ 4

g O dt 2 " с & О

Ю

С 1 ь л ("Ъ

CV л л

rl e4

1/ с 1 л (V

СЧ л

Ch л л (4 ф 1

1 (ч l

l

1

l

l

1

1

1

l

l

l !

l

1

1

1 !

1 I t

cd п1 I

I Я ф

Ф

Р tC

М 2! а

1 N а эоа t

1 1О X l0 I ь ь

Ю л л л

С ) 1

1

1 л

891776

)О

Таблица 2

Характеристика технологического процесса

Иэв ес тный Предлагаемый

Время проведения отдельных тех- нологический стадий, ч

12-15

Вымораживание и оттаивание культуральной жидкости

Фильтрация культуральной жидкости

2-3

Концентрирование нативного раствора

Сорбция на смоле КИТ

Ультрафильтрация элюата

18

Конечный продукт

Активность, ед/мг

Удельная активность, ед/мг белка

10-1 2

13-14

5-6

8-9,8

Формула изобретения

Составитель О.Скородумова

Техред А. Бабинец Корректор Г.Orap

Редактор Н. Рогулич

Заказ 11152/39 Тираж 531 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д..4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

1. Способ получения ферментного препарата 3-галактоэидазы, предусматривающий фильтрацию культуральной жидкости гриба-продуцента Curvuiaria

inaequal is штамм 75, сорбцию фермента из полученног о нативного раствора на катионообменной смоле с десорбци.ей цитратным буфером, ультрафильтрацию полученного раствора через аце-. татцеллюлозную мембрану и лиофильную сушку, отличающийся тем, что, с целью повышения ак-.изности целевого продукта, культуральную жидкость перед фильтрацией предварительно подвергают вымораживанию при (-15)-(-18)оС в течение 12-1$ ч, с последующим оттаиванием, а нативный раствор концентрируют перед сорбцией в 10 раз по объему путем ультрафильт рации с применением мембраны PTHK

00005.

2. Способ по п.l, о т л и ч а ю—

35 шийся тем, что в качестве катио-: нообменной смолы используют полимер, представляющий собой продукт сополимериэации метакриловой кислоты и триазина.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Авторское свидетельство СССР

II6596I2, кл. С 12 0 13/10, 1976 (прототип) .