Способ стабилизации подвергаемых пересеву линий клеток, контаминированных микоплазмами

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советских

Социалистических

Республик

«i>952957 (61) Дополнительное к авт. свид-ву(22) Заявлено 280481 (21) 328415р/30 15 с присоединением заявки МВ— (23) Приоритет

Опубликовано 230882. Бюллетень ¹ 31

fgq) g+ 3

С 12 М 5/00

Государственный комитет

СССР по делам изобретений и открытий (53) УДК 576 5 (088.8) Дата опубликования описания 230882 (72) Авторы изобретения

Л.П.Дьяконов, Н ° Н.Сухарева, A.A.Ïîýä

М.Т.Гололобова, В,.ВвГриценко, В.М.Ур ков юк и :. .Л. С:. Удалова (71) Заявитель ерийейт альной

Всесоюзный ордена Ленина институт эк ветеринарии (54) СПОСОБ СТАБИЛИЗАЦИИ ПОДВЕРГАЕМЫХ

ПЕРЕСЕВУ ЛИНИЙ КЛЕТОК, KOHTANHHHPOBAHHUX

МИКОПЛАЗМАМИ

1 2

Изобретение относится к ветеринар. ной вирусологии, в частности к куль. туре ткани, и может быть использовано в областных и республиканских вирусологических лабораториях, научно-исследовательских ветеринарных станциях и институтах при работе с клеточными культурами.

Применение культур клеток в вирусо-1О логических исследованиях, для диагностики вирусных инфекций и биофаб-: ричного производства противовирусных вакцин, диагностикумов вызывает необходимость разрабатывать методы культивирования, позволяющие сохранять стабильность культурально-морфологических свойств штаммов и линий клеток и их чувствительности к вирусам.

Одним из факторов, выэывакицих иэмеменения в культурах клеток и затрудняющих проведение вирусологических исследований, является контаминация микоплазмами, часто диагностируемая в перевиваемых клеточных линиях.

Контаминация клеточных культур может приводить к различным нежелательным последствиям, снижаквцим их ценность в вирусологической практике: дегенерации культур клеток, изменению З0 хромосом, метаболизма клеток, их митотической активности и антигенных свойств, Поэтому совершенствование способов деконтаминации и стабилизации культурально-морфологичвских культур клеток — актуальная проблема, решение которой позволит повысить надежность и достоверность проводимых исследований.

Известен способ стабилизации культурально-морфологических свойств перевиваемых линий клеток, контаминированных микоплазмами, включающий обработку клеток антибиотиками: тетрациклоном, тиланом, спирамицином и канамицином $1J .

Известен также способ стабилизации с помощью химических веществ — твина и тритона WR-1339 P2) .

Недостатком известных способов является токсическое действие на клетки культур и кратковременное стабилизирующее свойство антибиотиков и химических веществ в эффективных концентрациях, что приводит к изменению. характера роста клеточных культур, в частности к уменьшению потенции роста клеток.

Целью изобретения является повыаение эффективности способа атабилиза952957 ции культурально-морфологических свойств контаминированных линий клеток.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу, включающему обработку клеток биологически активным препаратом, в качестве биологически активного препарата используют полусинтетический препарат — моноэфир сахарозы и высших жирных кислот, а обработку осуществляют при каждом 10 пересеве от 3 до 8 раз в концентрации 5-10 мкг/мп.

Пример 1. Химический состав препарата:

Сахароза — 53%. 15

Жирные кислоты — 47: .С, -С, 4 0 — 12 3; C 0 9,0о

С ..0 — 10,0%ю С ь ..1 — 5к5" т С 7 ..0

1,4Ъ; С)7 .1 — 5,5Ъ; С в .0 — 2,43;

3,5-.

Способ осуществляется следующим образом.

Берут моноэфир сахарозы и высших 25 жирных кислот, взвешивают на аналитических весах в количестве, например, 500 мг. Это количество препарата растворяют в 20 мл бйдистиллированной воды, раствор стерилизуют 30 ,фильтрованием через миллипоровые фильтры. В 1 мл такого раствора содержится 25 мг вещества или 25000 мкг, 0,1 мл (,2500 мкг ) разводят в 0,9 мл питательной среды (ГЛА или Игла или

199), получают раствор в 0,1 мл которого содержится 250 мкг. Берут

0,1 мл (250 мкг) и вносят на 50 мл среды, т.е. в 1 мл питательной среды содержится 5 мкг препарата.

Полученный моноэфир сахарозы и высших жирных кислот используют для обработки контаминированных клеточных культур клеток, который добавляют в питательную среду в дозе

5-10 кгм/мл 3-8 раз до стабилизации культурально-морфологических свойств клеток.

Препарат применяется во время пе ресева.

Более низкая концентрация не оказывает стабилизирующего действия, более высокая — приводит к ухудшению культурально-морфологических свойств клеток в культуре.

Стабилизация культурально-морфологических свойств включает в себя подавление развития микоплазм, выравнивание рН питательной среды, ее проз. рачность, четкую морфологию клеток, специфическую для данной культуры (исчезает зернистость границы клеток, хорошо просматриваются), увеличение прироста. клеток, монослой клеток формируется значительно раньше, отсут ствие разрывов и "окон" в клеточном 65

1 пласте, происходит увеличение сроков сохранения монослойной культуры на стекле (увеличивается на 4-6 дней) и повышение чувствительности клеток к вирусам на 0,5-1,0 lg.

Препаратом обрабатывают подвергаемые пересеву линии клеток, контаминированные микоплазмами.

II p M e p 2. B опыт взята культура СПЭВ 87 пассажа. Препарат вносят в питательную среду при пересеве клеток в дозе 10 мкг/мл. Обработку культуры проводят в течение 6 пассажей. После обработки наступает стабилизация культурально-морфологических свойств клеток.

Пример 3. В опыт взята культура клеток КТТ 62 пассажа. Препарат вносят в питательную среду при пересеве клеток в дозе 5 мкг/мл. Обработку культуры проводят в течение

5 пассажей. После обработки наступает стабилизация культурально-.морфологических свойств клеток.

Всего предложенным способом обработано 300 матрасов с различными перевариваемыми клеточными культурами с получением положительного эффекта.

После обработки препаратом состояние культур заметно улучшалось: границы клеток становятся четко выраженными, исчезает помутнение питательной среды и не происходит ее значительного закислкния. Клетки интенсивно размножаются с большим коэффициентом пересева (прирост клеток в 2 раза больше). Клеточный пласт формируется в более короткие сроки (на 1-2 дня быстрее), Последующее пассирование клеток позволяет их поддерживать в хорошем морфологическом состоянии и постоянно получать значительный прирост клеток без видимых цитологических изменений.

После обработки культивирование клеток продолжают на питательной среде, содержащей стандартные антибиотики (пенициллин и стрептомицин по 50 — 100 ед/мл) в течение 2025 пассажей. Затем, в случае необходимости, культивирование вновь проводят на среде с добавлением моноэфира сахарозы и высших жирных кислот до 3-8 пассажей, после чего клетки снова культивируют на среде со стандартными антибиотиками.

Предлагаемый способ стабилизации, благодаря периодическому введению в культуральную среду биологически активных веществ, позволяет успешно подцерживать стабильные культурально-морфологические свойства перевиваемых клеточных линий.

Стабилизированные клетки поддерживаются серийными пассажами длительное время(1-2 года срок наблюдения), 952957

Формула изобретения

Составитель О. Петрачева

Техред M.Тепер Корректор В.БУтлга

Редактор Г.Волкова

Заказ 6215/43 Тираж 505 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5

Филиал ППП "Патент", r.Óæãoðîä, ул.Проектная,4

Способ стабилизации подвергаемых пересеву линий клеток, контаминированных микоплазмами, включающий обработку культур клеток биологически активным препаратом, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью повышения эффективности способа, в качестве активного препарата используют полусинтетический препарат — моноэфир сахарозы и высших жирных кислот, а обработку осуществляют при каждом пересеве от 3 до 8 раз в концентрации 5-10 мкг/мл.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Осидзе Д.Ф. Значение микоплазм в вирусологии и их роль в патологии ,животных. М., 1970, с.56-57 °

2. Wolford R.G. et al. "Арр1 Hicrob i o l ". 1972, 24, Ð 1, р.18-21.