Ордена Трудового Красного Знамени институ «микфс@иологии : / и вирусологии им. Д.К.Заболотного и Институт Вюнмцйи им. А.В.Палладина j (72) Авторы изобретения (71) Заявители (54) ШТАММ РЗЕОООМОМАБ МЕМООС!НА

3121-ПРОДУЦЕНТ ХОЛЕСТЕРОЛЭСТЕРАЗЫ

Изобретение относится к микроби ологической промышленности, точнее к области получения ферментов путем микробиологического синтеза.

Холестеролэстераза - фермент, расщепляющий стероловые эфиры с образо» ванием холестерина и высших жирных кислот, представляет интерес в связи . с его действием на трудно гидролизуемые эфиры холестерина, накапливающиеся в значительных количествах в крови больных коронарным атеросклерозом.

Известны различные штаммы, продуцирующие холестеролэстеразу. Так известны штаммы бактерий Nocardia

cho1estего1icum NRRL 5767 и 5768 " продуценты холестеролэстеразы при культивировании на питательной сре" де, содержащей индуктор и экстрактор дрожжей, обладающих невысокой активностью (1 ).

Наиболее близкими к предлагаемому по технйческой сущности и достига2 емому положительному эффекту являются штаммы Pseudomonas f1иогезсепь

МУ 3955 или 4032, 3975, 3081 и 31156.

Специфическая удельная активность ферментов-сырцов составляет 0,012ед/мг белка. Фермент не обладает узкой субстратной специфичностью: наряду со способностью гидролизовать эфиры хо» лестерина, он обладает и липолитической активностьюР., Недостатком известных штаммов является то, что синтез фермента бактериями происходит лишь при добавлении в питательную среду индукторов (сложных эфиров холестерина, жирных кислот или их эфиров и др. соединений). В отсутствии индукторов в среду выделяются лишь следы холестеропэстеразы.

Целью изобретения является выделение из бактерий рода Pseudonionas штамма-продуцента холестеролэстеразы, обладающего повышенной активностью.

3 96611

Предлагаемый штамм 3121 относится к виду Pseudomonas mendocina, последний является новым источником выделения холвстеролэстеразы.

Штамм P. mendocina 3121 выделен в отделе антибиотиков Института микробиологии и вирусолог и АН Украинской CCP из активного ила в 1972 r.

Биохимическое изучение биологически активных метаболитов Pseudî- 1î

monas mendocina 3121 проводилось отделом антибиотиков Института микробиологии и вирусологии АН Украинской CCP совместно с отделами биохимии ферментов и биохимии стеринов з

Институтэ биохимии АН Украинской CCP.

Штамм Pseudomonas mendncina 3121 храниЧся в коллекции Центрального

Музея института "ВНИИгенетика", коллекционный номер ЦМПМ В-2.173.

Штамм Pseudomonas mendocina 3121 имеет следующие морфологические, культуральные и фйзиологические.характеристики °

Морфология. Грамотрицательные палочки, подвижные, монотрихи. Включейий поли-р-оксимасляной кислоты не образуют.

Культуральные свойства. На мясопептонном агаре-колонии гладкие, круглые, блестящие, пастообразные, на HRco-nåïòoííoì бульоне - равномерная муть. Бактерии не синтезируют желто-зеленый флюоресцирующий пигмент, характерный для многих видов бактерий рода Pseudomonas, образуют желтый внутриклеточный пигмент каротиноидной природы . физиолого-биохимические свойства.

Строгие аэробы используют глюкозу только по окислительному пути. Оксидазоположительные по Ковачу. Оптимальная для роста температура 27 С, при 42ОС растут. Йнаэробно расщепляют аргинин, не обладают левансаха" разами, липазами и лецитиназами, активные денитрификаторы, крахмал, желатин, эскулин не гидролизуют, глюконат не окисляют, хинную кислоту не превраЩают в протокатеховую., чувствительны к нитрофурантоину.

Источники азота. Усваивают аммиачные 1 нитратные формы азота.

Источники углерода. В качестве

1 единственного источника углерода штамм Pseudomonas mendocina 3121 ис- М пользует свыше 30 органических соединений разнообразного химического строения, в,том числе глюкозу, раз5 личные органические кислоты (капри-. ловую, малоновую, янтарную, фумаровую, глютабовую, молочную, гликолевую, пировиноградную, лимонную, с4-кетоглютаровую, итаконовую, яблочную); полиспирты, гликоли и низшие спирты (маннит, слабо - этанол, пропанол и бутанол); из ароматических соединений - хинную кислоту, аминокислоты (глицин, о - и р -аланин, И -аргинин, глютаминовую и -аминомасляную,кислоты, пропил); некоторые азотистые соединения (бетаин, саркозин), а также среднецепочечные Н-алканы . с числом углеродных атомов от С„4 до

С22 °

Не усваивают в качестве единственного источника углерода: ксилозу, сахарозу, арабинозу, маннозу, галактозу, трегалозу, мальтозу, целлобиозу, крахмал, салицин; кислоты: малеиновую, адипиновую, пимелиновую, винную M- и П- оксибензойную, гиппуровую, фенилуксусную, сорбит, иноэит, фенол, лейцин, саркозин, ацетамид и фолиевую кислоту.

Условия хранения культуры. Суточную культуру бактерий засевают уколом в высокий столбик 0,5i мясо-пептонного агара и после 48 ч роста при

27 .С заливают 2-3 мл стерильного вао. эелинового масла. В этих условиях штамм-продуцент хранится без пересевов не менее 4 лет при комнатной температуре. Для повседневной работы бактерии высевают из исходной музейной культуры на. скошенный мясопептонный агар, на котором у них сохраняется способность к дальнейшим пересевам в течение 10 дней.

Пример I. Получение фермента путем культивирования штаммавЂ” продуцента на среде без индуктора.

Определение его специфической активности. а) Культивирование штамма-продуцента.

Культуру Pseudomonas mendocina

3121 выращивают на скошенном мясопептонном агаре, температура 27 С, смыв суточной культуры вносят в среду, разлитую по 100 мл в эрленмейеровские колбы объемом 0,75 л, Состав среды, г/л:

Глюкоза 20,0

Мочевина 1,0 кто

a VPO< 0,5

66115,5 9

NaC1 0 5

Водопроводная вода Остальное

Время выращивания 24 ч, температура 270С.

Полученная клеточная суспензия служит посевным материалом для последующей Ферментации.

10 литров питательной, среды приведенного состава разливают по 100 м в 0,,75 л колбы Эрленмейера, стерилизуют текучим паром при 115 С в течение 20 мин и засевают. 24-х часовой культурой Pseudomonas mendocina 3121, выращенной на питательной среде в условиях аэрации при 27 С, Объем посевного материала на каждую колбу 4 мл. Ферментацию проводят в условиях аэрации на круговой качалке (220 об/мин) при 27оС .в течение !20 ч. б ) Способ получения эстеразы холестерин-олеата.

Культуральную жидкость отделяют от клеток центрифугированием при

+50С на центрифуге К-70 или IQP-1 при 2500 об/мин в течение 30 мин.

Надосадочную жидкость сливают, осадок удаляют.

К надосадочной жидкости порциями, при постоянном помешивании (комнатная температура), добавляют охлажденный (-20оС} этанол, до конечной концентрации 654 и оставляют стоять в холодильнике (при помешивании)

30 мин. Появившийся осадок отделяют центрифугированием при тех же условиях.Надосадочную жидкость удаляют.

Полученный осадок суспендируют в минимальном объеме охлажденной дистиллированной воды (50 мл воды на весь осадок, полученный из 1 л культуральной жидкости). в атеросклеротической аорте (Н п1апsku, 1973) .

Приготовление раствора субстрата, Змульгатором субстрата является альбумин, активатором вЂ” дезоксихолат натрия. Оптимальное соотношение указанных ингредиентов олеата холестерина, альбумина, дезоксихолата 1:3:2.

Раствор субстрата готовят из расл 1 чета 3,3 мг олеата холестерина в .1 мл по следующей схеме: холестериновый эфир олеиновой кислоты растворяют в минимальном количестве хлороформа в центрифужной пробирке с последующим удалением его в токе азота. После образования на стенках пробирки пленки добавляют 9,9 мг альбумина и 6,.6 мг дезоксихолата натрия.

Все ингредиенты растворяют в фос20 .Фатном буфере (рН=7,5) и гокогенизируют трижды при 5000 об/мин в течение 5 мин (гомогенизатор МРЧ-324).

Приготовление раствора фермента °

Препарат растворяют в фосфатном.

2 буфере (рН=7,5) из расчета 3,3 мг белка в 1 мл раствора.

Проведение субстратной ферментативной реакции, Используют соотношение фермента

30 к субстрату в реакционной смеси 1:2, Колбочки со смесью 2 мл раствора субстрата и 1 мл раствора фермента помещают на водяную баню (t =37 С).

Реакция проходит при встряхивании в течение 30 мин, ее прерывают добавлением 3-х кратного количества смеси серного эфира, гексана и этилового спирта (l:1:1). В контрольных варантах реакцию прерывают сразу же после добавления фермента к субстрату. Экстракцию продуктов гидролиза проводят той же смесью.

Высушенные неомыляемые остатки после проведения субстратной фер ментативной реакции анализируют методом газожидкостной хроматограФии с целью определения свободного холестерина, образовавшегося при гидролизе эфира холестерина и олеиновой кислоты. Хроматограф 31, наполнитель спгояаСоп М-AW Super 34 силикона, колонка стеклянная 1,8 м, давление на . входе в колонку

1,85 кг/см, температура 250 С.

Полученную суспензию высушивают лиофильно с использованием жидкого азота (-1950С) до получения мелкодисперсного порошка - фермента-сырца, в котором определяют содержание белка по методу Lowry, 1951. Выход фермента-сырца 0,35 г на 1 л культуральной жидкости, содержание белка в препарате 29,2/. в) Определение специфической холестеролэстеразной активности.

В качестве субстрата для гидролиза используют олеат холестерина, поскольку он являешься основным эфиром

Пробы перед анализом растворяют в смеси серный эфир: гексан 1:l, объем пробы для исследований 5,кГ.

Расчет активности Фермента.

7 9661

За единицу активности холестеролэстеразы принимают количество фвржнта, катализирующее отщепление от холестеринаолеата;..одного микромоля холестерина в мин (Sugiura и др., З

1976) .

В результате проведения ферментативной реакции по предложенной схеме 3,3 мг белка фермента за 30 мин катализирувт отщепление 400 кг хо«. 1© лестерина. Исходя из этого, единица активности фермента 96 мг, à специфическая удельная активность (количество единиц активности в 1 мг белка фермента) 0,01 ед/мг белка.

15 . фермент-сырец из штамма Pseudoпюпаэ аепоос1па 3121 не обладает.ли= .. политической активностью (субстратоливковое масло).

Пример 2. Получение холесте- © ролэстераэы путем культивирования штамма-продуцента на среде с индуктором.

Для получения noceeoro материала штамм Pseudomonas mendoci.па 3121 вы- > ращивают в условиях аэрации на синтетической среде описанного состава:.

Посевной материал, полученный после

24"x ч культивирования, вносят в количестве 4 мл в 0,75 л колбы Эрлен- 3О мейера, содержащие по 100 мл среды следующего состава, г/л:

Глюкоза 20

Мочевина - 1

К N03 1

К НРО . О, 5

NaCl 0,5

Олеат холестерина 3

Водопроводная

49 вода Остальное

После 120 ч выращивания клетки отделяют центрифугированием и из культуральной жидкости получают фермент-сырец по методике как в примере 1..

15 8

Выход Фермента 1,56 г на 1 л куль-. туральной жидкости, содержание бел- . ка в последнем .18,23.

Единица активности фефмент 23 мг, удельная специфическая активность

0,04 ед/мг белка.

Таким образом, штамм Pseudomonas

mendocina 3121 продуцирует значительные количества фермента на простой синтетической среде в отсутствии индуктора. В присутствии холестерина и его эфиров, взятых в качестве индукторов, специфическая активность синтезируемого фермента возрастает в

2-3 раза.

Способ получения холестеролэстераэы путем биологической ферментации прост, продуктивен, экономически выгоден. Холестеролэстераза из Pseudomonas mendocina 3121 может быть использована для количественного определения общего холестерина сыворотки крови при диагностике и леча" нии атеросклероза, церебральных геморрагий и расстройств печени. Представляет интерес исследование возможностей применения этого фермента в качестве лечебного средства при атеросклерозе..

Формула изобретения

Штамм Pseudomonas mendocina (коллекция Центрального Музея института

"ВНИИгенетика", коллекционный номер

ЦИПМ В-2173), продуцент холестеролэстеразы.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1, Патент Франции н 2362927, кл, С 12 0 13/1О, опублик, 1978.

2. Авторское свидетельство СССР

tf 2274686, кл. С 12 D 13/10, опублик.

1976 (прототип). !

Заказ 77 1 3 Тираж 505 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент, г. Ужгород,ул, Проектная, Составитель И,Привалова

Редактор А.Химчук Техред Л. Пекарь Корректор О. Билак

Штамм рsеudомоnаs меndосinа 3121 продуцент холестеролэстеразы

Штамм erwinia саrотоvоrа мл-1-продуцент транс-элиминазы // 960256

Штамм плесневого гриба aspergillus аwамоri-10-3-продуцент @ -галактозидазы // 958503

Штамм sсеnеdеsмus овliguus 885, используемый для очистки промышленных сточных вод от цианистых соединений натрия и калия // 947185

Штамм nocardia sp км-2 используемый для очистки промышленных сточных вод от пиридина // 943281

Способ конструирования штаммов еsснеriснiа coli-продуцентов рестриктазы и метилазы е со r @ // 941423

Способ отбора лизогенных штампов холерных вибрионов // 940520

Штамм плесневого гриба aspergillus oryzae-3-продуцент @ - амилазы // 933704

Штамм еsснеriснiа coli в 834 ( @ @ )/pbr 322 // 918304

Химерное моноклональное антитело, взаимодействующее с человеческой плацентарной щелочной фосфатазой, вариабельная область тяжелой гамма-цепи химерного моноклонального антитела, вариабельная область легкой k-цепи химерного моноклонального антитела, фрагмент кднк, кодирующий вариабельную область тяжелой гамма-цепи химерного моноклонального антитела и фрагмент кднк, кодирующий вариабельную область легкой k-цепи химерного моноклонального антитела // 2102479

Изобретение относится к специфическим связывающим агентам, в частности к полипептидам, которые содержат аминокислотные последовательности, специфически связывающиеся с другими белковыми и небелковыми веществами

Рекомбинантная плазмидная днк pgii, определяющая синтез бета-интерферона человека в трансгенных растениях, и способ получения трансгенных растений, устойчивых к вирусной инфекции // 2103361

Набор для обнаружения антител к бледной спирохете treponema pallidum, рекомбинантный полипептидный антиген treponema pallidum 15 кда, рекомбинантный полипептидный антиген treponema pallidum 17 кда и рекомбинантный полипептидный антиген treponema pallidum tmp a // 2103362

Рекомбинантная плазмидная днк рвтn ii, определяющая синтез кристаллического инсектицидного дельта-эндотоксина cry iiia- типа, способ ее конструирования и штамм бактерий pseudomonas putida, содержащий рекомбинантную плазмиду днк рвтn ii-продуцент кристаллического инсектицидного дельта- эндотоксина cry iiia-типа, активного против насекомых отряда coleoptera // 2103363

Последовательность днк, белок и способ получения белка // 2103364

Изобретение относится к цефалоспоринацетилгидролазному гену, белку, содержащему аминокислотную последовательность, кодируемую указанным геном и представляющему собой мультимер, предпочтительно тетрамер или октамер, а также к методу получения указанного белка

Аналоги инсулина человека, способ их получения, раствор для инъекций // 2104305

Изобретение относится к новым аналогам человеческого инсулина, отличающимся быстрым наступлением требуемого эффекта после подкожной инъекции, и растворам инсулина для инъекций, содержащим подобные аналоги инсулина и к способам получения новых аналогов инсулина

Очищенный фолликулостимулирующий гормон (фсг), фармацевтическая композиция, компонент фармацевтической композиции // 2105012