Штамм аrтнrовастеr species всти-5-продуцент нуклеотидов и рибозо-5-фосфата

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

R ABT©eC ©MV CBHQETEllbCTBY

Союз Советскик

Социалистических

Республик

< 960258 (61) Дополнительное к авт. свид-ву(22) Заявлено240481 (21) 3278267/28-13 с присоединением заявки Йо 3278266/28-13 (И)М.Кп

С 12 .N 15/008

С 12 .Р 19/30

С 12 N 15/00

С 12 R 1/06

Государственный комитет

СССР но делам изобретений и открытий (23) Приоритет—

РЗ) УДК 663.18

Опубликовано 2309.82. Бюллетень М 35

Дата опубликован я описания 230982

A (088. 8) Московский ордена Трудового Красного Знамени технологический институт пищевой промышленности (71) Заявитель (54) IIITAMM ARTH R08ACT E R SPEC I E S ВСТИ-5-ПРОДУЦЕНТ

НУКЛЕОТИДОВ И РИБОЗО-5-ФОСФАТА

Изобретение относится к микробиологической промышленности у в частности к получению лекарственных препаратов и реактивов нуклеотидов, а так,же основы для их химического и ферментативного синтезов — рибозо-5-фосфата. и представляет собой штамм, который пои определенных условиях культивирования накапливает в среде рибозо-5-фосфат гуанинфосфорибозилтрансФеразу ГФРТ-азу и синтезирует из внесенных оснований соответствующие нуклеозидмоно-, ди- и трибосфаты, В нашей стране нет производства . нуклеотидов. а импорт их ограничен 15 высокой стоимостью. Химический синтез этих соединений дорогой. многоступенчатый, требует сложного оборудования. Перспективен микробиологический .синтез данных веществ„ Развитие микробиологического способа получения нуклеотидов и рибозо-5-фосфата сдерживает отсутствие стабильного и продуктивного штамма.

Известен поодуцент нчклеотидов (11 .

Однако такой поодуцент отличается невысоким выходом и нестабильностью синтеза нчклеотипов, оибозо-5-фосфата.

Потребность страны в оазличных нуклеотипах. их производных, рибозо-5-Фосфата ГФРТ-азы, испольэуемой дюжая получения ГМФ, непрерывно растет в связи с оазвитием исследований в области биологии, медицины.

Кроме этого, гуанозинмонофосфорная кислота (5-ГМФ) применяется в качестве интенсификатора вкуса и повышения питательной ценности различных пищевых поопчктов. Ввипу ее абсолютной нетоксичности в качестве добавок предполагается дальнейший DocT потребности в этом соединении. Получение гуаниновых нуклеотидов с помощью ауксотрофных .мутантов в настоящее время представляет большие трудности, так как гуаниновые нуклеотиды ингибируют.по прин- . ципу обратной связи начальные реакции биосинтеза пуринов de novo. Поэтому с помощью мутантов можно получать лишь природные нуклеозидмонофосфаты (ГМФ) в ограниченном количестве. а народному хозяйству требуются различные нуклеотиды, их аналоги, применяющиеся в медицине для лечения злокачественных опухо-! лей. Поэтому актуален поиск штамма — продуцента нуклеотидов,.а:также

960258

4 основы для их синтеза. синтеза раэ- и желтоватого цвета. Пигмент в среличных соединений - рибозо-5-фосфа- де не диффундирует. Среда Гауэе,глита, который .также импортируется. ; цериново-аспарагиновый агар, среда

Наиболее близким к предлагаемая у Сабуро. — к десяти суткам роста обраштамму является отечественный проду" зуются слабые точечные, прозрачные цент АТФ и незначительных количеств 5 колонии. Среда Чапека с крахмалом—

ГТФ Corynebacterium species ВСТИ- . рост алабый, мелкие округлые, бесцвет.301@).,.ные колонии.

Недостатком известного продуцен- Физиологические признаки1 та является то, что при его исполь- По отиошецию к кислороду — факульэовании требуется предварительная Я тативный анаэроб. Оптимальная темпеочистка питательных сред от ионов ратура роста 28-37 С, при .15,41 рост

0 д марганца и цинка, которые сильно ли- слабый, при 4,45 С роста нет. Молоко

d митируют синтез нуклеотидов иэ осно с метиленовым синим не. изменяет. Жеваний этой культурой. Для приготов- латин.не разжижает. Крахмал, клетчатления.сред требуется использованиЕ, g Ку ие гндролизует. Сероводород, индол, высокоочищенных реактивов, дистилли- фцетилметилкарбинол, аммиак не оброванной воды. разует. Нитраты редуцирует до нитКроме того. известный штамм об- ритов. Пробы,на каталазу, уреазу по" ладает нестабильностью синтеза нукле- ложительные. усваивает глюкозу, фрукотидов, не накапливает в среде Рибо" тозу, сахарозу, манноэу, ксилозу, эо-5-фосфат, исключает применение для рибозу, арабинозу, галактозу, лактополучения их дешевых питательных зу, мальтозу, раффинозу, инозит, дульсред. цит, маннит, глицерин. На глюкозе, целью изобретения является прове" фруктоэе, сахароэе образует кислодение поиска и отбор культуры. спо" ты, но не газ. В качестве источника собной накапливать в среде рибозо- азота использует для роста различные

-5-фосфат аденин- и гуанинфосфорибо- аммонийные соли; многие природные зилтрансфераэ (АФРТ-азы и ГФРТ-аэы), аминокислоты: Хранят .штамм при и синтезировать иэ внесенных основа- 5-8 С на косяках с MIIA. о ний соответствующие нуклеотиды. Пример. 1. Ферментация. поставленная цель достигается -3О Посевную культуру. Arthrobac ter следующим образом. В результате " spesies ВСТИ-5 выращивают в течепоиска и отбора из природных источни- ние суток на качалке (220 об/мин, ков. выделяют штамм, способный накан- при 3031 C) в колбах Эрленмейера ливать в соеде рибозо-5-Фосфат и син" на 250 мл с 10 мл среды. Состав тезировать из экэогенных оснований 35 посевной среды, %> глюкоза 2,0, соответствующие нуклеотиды. Штамм де- пептон 1,0, дрожжевой экстракт 1,0; понирован во ВНиИантибиотиков, регист- ИаС1 0,3, РН .7,3. Посевной материал рационный номер 1630 эарегистриро- 10% (по объему) переносят в ферменван Международной Федерацией коллен" тационную среду, %s глюкоза 10;О; ции культур в реестре под 9 337- 4О К НРО4,1,0; КН РО,1,0; MgS04.7Н О 1 „О;

Характеристика штамма Arthrobacter CaCI<2H<0 0,01; пептон 1,0; дрожspecies ВСТИ-5. жевой экстракт 1,0; мочевина 0,6;

Морфологические признаки. РН 8,3. Мочевину стерилизуют при

Бактерия, клетки которой располо- 0,5 ати, 15 мин, РН сред доводят жены попарно, V-образно, встречают- 45 5 н.КОН до стерилизации и стерилися и одиночные клетки, с округлен- зуют пфи 1 ати, 20 мин. Выращивание ными концами, размеры 0,6-1.0x . в течение 3 сут. проводят в таких х1,.2-3,0 мкм. Жгутиков нет, неподвиж- . же условиях, как и посевной материная. Граммположительна,, некислото- an. Для выделения рибоэо-5-фосфата устойчива. Запасные вещества представ- используют культуральную жидкость лены волютиновыми зернами (полифос- ® пятисуточной культуры. Для синтеза фаты), которые к пяти суткам роста нуклеотидов в трехсуточную культуна MBA располагаются в клетке поляр- ру вносят в качестве их предшестио, придавая ей "гантелевидную форму венника сухой препарат основания .—

МПА. Рост хороший, после двух суток гуанин хлорид иэ расчета 3 мг/мл роста при 30 С образует колонии 0 ° 5- 55 среды и продолжают иикубацию на ка0,8 см в диаметре, желтоватого цве- чалке еще двое суток. Одновременно та, с ровным краем, выпуклые, HeTIpo3" с гуанином в среду вносят ксилол рачные, с ровной поверхностью мато- иэ расчета 15 (по объему). вые, маслянистой консистенции, легко Определение нуклеотидов. суспендируется водой МПБ. Рост, уме- dQ Культуральную жидкость, после . ренно мутный, пленку на поверхности удаления клеток центрифугированием не образует, осадок рыхлый белыйt при 50000 ха, 10 мин обрабатывают аморфный. На среде с отваром Хоттин" хлорной кислотой 1,2н, нейтрали- гера к трем суткам роста образует Ко- зуют ЗОВ-ной KOH и хроматографионии 1,0-1,5 см в диаметре, желтого dg руют на бумаге "FN-1 " в системе

960258 растворителей иэомасляная кислота— П р и м е Р 4. Условия фермента1 н. аммиак — ледяная кислота ции такие же. как и. в примере 1.

10 5:1,. РН 3,8, нисходящая, при 28 С. только вместо гуанина вносят урацил. 0

Пятна нуклеотидов, соответствующие Выход УМФ (уридинмонофосфорной кислосвидетелям на хроматограмме, выре- - ты) 2.0 мг/мл. зают и элюируют в течений суток 3 мл Пример 5. Условия Ферментации

0,1 н. НС1. Количество нуклеотидов : такие же. как и в примере 1. только рассчитывают с переводными коэффици- вместо гуанина вносят соответствуюентами УФ-поглощающих элюатов при щие нуклеоэиды вместо гуанина

260 нм . гаунозин. аленина — апенозин. гипоксанИдентификацию отдельных нуклеоти- 0 тина — инозин. урацила — уридин, выдов проводят путем сравнения. их ходы образовавшихся АТФ, АДФ, АМФ, Rf с .Rf свидетелей на хроматограм- гГТФ, ГДФ, ГМФ, ИМФ, УМФ были выше ме, спектрофотометрическими методами незначительно. (Уф-спектры), химическими — опреде- Пример 6. Ферментация. Посевление.рибоэы (орцинольным методом 15 ную кУльтУРУ АгйЬгоЬасйег species по Мейбаум), фосфора (по Фиске-Суб- ВСТИ-5 выращивают в течение суток бароу), основания (спектрофотомет- . на качалке (220 об/Мин, при 30++ рически при 260 нм), определение и <в колбах Эрленмейера емкостью 250 мл .молярного соотношения. Содержание с 10.мл среды следунхцего состава, %I нуклеотидов, образовавшихся.,в. куль- ; глюкоза 2,0; пелтон 1,0, мясной эксттуральной жидкости, выражают в . Ракт 1,0, NaCI 0,3, РН 7,3. Посевной мг/мп среды. " . материал (10% по объему) переносят

Выделение. Рибозо-5-фосфата. в ферментационную среду, В глюкоза

Культуральную жидкость, свободную 10,0, К НРО4 1,0 КН4Р041,О, от клеток,.обрабатывают активирован- 25 MgSQg ° 7Й О .1,0; CaCIg 2Н О 0,01, . ным углем "CA" фирмы " Sigma для .. мясной экстракт 0,8; мочевина 0.,6, . удаления- белков и УФ-.поглощакщих . пептон 0,5; РН 8,3. Мочевину стери, веществ нуклеиновой природы. Адсорб-,лизуют отдельно при 0,5 ати, цию проводят на холоду при перемеши- 15 мнн, РН сред доводят 5 н. КОН ванин в течение часа. Контроль за ад-З-О до стерилизации и стерилизуют.при 1ати, сорбцией осуществляют, измеряя погло.- 20 мин. Выращивание в течение 3 сут щение при 260 нм. Уголь удаляют цент- проводят в тех же условиях, что и порифугированием при 10000х, 30 мин., севной материал. Из трехсуточной кульСупернатант используют для выделения туральной жидкости удаляют клетки .Рибозо-5-фосфата ионообменной хрома- центрифугированием при 10000х б. тографией на колонке с Дауэкс-1, . 15 мин. Супернатант используют -для (формиатная форма) по методу Флакса. фракционирования охлажденным до -15 С, Рибозо-5-фосфат может быть выделен этанолом до 50% насыщения, для чего из.элюатов в виде бариевой соли. Для приливают медленно равный объем этаэтого фракции, содержащие рибозо-. 5-. иола. Осадок собирают центрифугирова-фосфат, объединяют и упаривают на 40 -нием при 5000m g, 10 мин, Растворяроторном испарителе до нужного объема ют в 50 мМ трис-НС1 буфере, РН 7,5.

: при те пературе не выше 30-35 С. Под- Определение активности аденин- и щелачивают до РН 8,5 гидроокисью .гуанинфосфорибозилтрансферазы бария, затем на холоду добавляют трех- (АФРТ и ГФРТ) проводят по Шлоссбергу. кратный объем этанола, осадок со- 45 B работе используют меченые соепи" бирают центрифугированием при, ненйя В/О "Изотоп" - аденин С (удель5000x q, 10 .мин, промывают этанолом, ная активность. 4,1» 10 имп/мин/мкм), эфиром и сушат в вакуум-эксикаторе. гуанин- С (удельная активность 4,6 х

К пяти суткам культивирования проду- . х 10 имп/мин/мкм). Счет радиоактивцента в определенных условиях в сре- я ности осуществляют на сцинцилляциоиде накапливается до 4 г/л рибозо- ном счетчике СБС-1 с эффективностью

-5-фосфата. счета 60% ° Активность ферментов выражают в нм синтезированного нуклеоПример 2. Условия Фермен- зидмонофосфата за минуту,, иа мг белтации такие же . как в примере 1, только в качестве предшественника вносят аденин. Выход АТФ (аденозин- Препараты нуклеотидов необходим трифосфорной кислоты ) 2 .О мг/мл . для различных областей народного хо-.

АДФ (аденозиндифосфорной кислоты) . зяйства, медицины. биологии, синтеза

0.5 мг/мп,. АМФ (аденозинмонофосфор- различных соединений. Так. ГДФ иеной кислоты) 0,5 мг-,мл. .6 обходима ддя синтеза полигуаниловой

Пример 3. условия фермента- . кислоты, обладающей высокой противо" ции такие же, как и в примере 1, вирусной активностью. В нашей стране только в качестве предшественника АТФ получают-из мяса, а остальные нуквносят гипоксантин. Выход ИМФ (ино-, леотиды и рибозо-5-фосфат импортируют" зинмонофосфорной кислоты) 3.0 мг/мп. 65 ся по очень высокой стоимости. Расту960258

Составитель М.Ларина

Редактор Л.Лукач ТехредМ.Гергель Корректор Е.Рошко:

Заказ 7149/31 Тираж 505 Подписное

ВНИИПИ Госудаоственого комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035. Москва. Ж-35. Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 щие потребности страны в нуклеотидах и рибозо-5-фосфате не удовлетворяются их производством. Предложенный штамм Arthrobacter species

ВСТИ-5 позволяет получать природные нуклеотиды ACPT-азы и ГФРТ-азы и рибоэо-5-фосфат, используя дешевые среды, которые в дальнейшем могут быть заменены на более рентабельные комплексные среды, так как синтез нуклеотидов и рибозо-5-фосфата предлагае- tO мым продуцентом не зависит от присутствия в среде ионов марганца и цинка.

Штамм в определенных условиях на,капливает в среде к пяти суткам, 15 культивирования до 54 г/л рибозо-5-фосфата. При внесении соответствуюших оснований или нуклеоэидов синтезирует: из аденина — АТФ

2.0 г/л,,АДФ 0,5 г/л", АМФ 0,5 r/é; иэ гуанина — ГТФ 2,5 г/л, 4;ДФ

0,8 г/л", ГМФ 0,5 г/л, гипоксантинаИМФ 3,0 г/л, иэ урацила 2 г/л, накапливает в среде ферменты пуринового обмена - аденин и гуанинфосфорибоэилтрансферазы с активностью к 72 ч ферментации 18 нм мС АМФ в минуту на мг белка и 64 нм С 4

ГМФ в минуту на мг белка.

Формула изобретения

Штамм Arthrobacter species

ВСТИ-5 (депонирован"во Всесоюзйом научно-исследовательском инсти- туте антибиотиков, М 1630) продуцент нуклеотидов и рибозо-5-фосфата.

Источники информации, ! принятые во внимание при экспертизе

1. Авторское. свидетельство СССР

9 395082. кл. С 12 P 19/32. 1971.

7,. Авторское свидетельство СССР

Р 726161..кл. С 12 D 13J06, 1977.