Способ получения кининазы
Союз Советсник Социалистических Республик Qn Nt AHHE ИЗОБРЕТЕН ИЯ К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) дополнительное к авт. свнд-ву (22) ЗаЯвлено 13, 10.80 (21) 3212843/28-13 (5! )М. Кл. А 61 К 35/56 с присоединением заявки М 9@уддраеаам6 квинтет СССР ае ймам взвбретений н открытка (23) Приоритет Опубликовано 07.11.82. Бюллетень A@41 (53) УДК663.53 (088. 8) Дата опубликования описания 07. 11,82 (72) Авторы изобретения А.С.Садыков, A.Àõóíîà и 3.Голубенко Институт биоорганической химии АН Узбекской CCP (71) Заявитель с (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КИНИНАЗй Изобретение относится к области биологии и касается методов выделения ферментов из сырья животного происхождения. Известен способ получения кининазы из сырья животного происхождения, включающий гельфильтрацию с последующей элюцией буферным раствором и ионообменную хроматографию (1) Однако известный способ не обеспечивает получение фермента с достаточно высокой ферментативной активностью (0,07 мкг экв, на 1 мг белка в I мин), Целью изобретения является повышение ферментативной активности. Поставленная цель достигается тем, что в способе получения кикиназы из сырья животного происхождения, включающем гельфильтрацию с последующей элюцией буферным раствором и ионообменную хроматографию, в .качестве источника сырья используют )яд паука Latrodectus tredecingiitta2 tus, который подвергают гельфитрации на сефадексе G-50 с элюцией 0,005 И аммонийацетатиым буферным раствором, затем полученную nepsye фракцию разделяют ионообменной хроматографией на колонке с диэтиламиноэтилцеллюлозой и элюируют фермент аммонийацетатным буферным раствором. Пример. Выделенный яд паука каракурта в количестве 1 г разделя,ют на сефадексе С-50 в 0,005 M аимонийацетатном буфере рН 7,8, размер колонки (2,5<60 см), скорость вытекающей жидкости 30 мл/ч. Б результате разделения яда получают три фракции. Высокая кининазная активность обнаружена только в первой фракции, ее объем составляет 45 мл, содержание белка 660 мг, вторую фрак го цию получают в количестве 35 мл и третью фракцию в количестве 35 мл, но не используют. Для дальнейаей очистки первую . Фракцию (45 мл) разделяют на колон1340 Формула изобретения Составитель В,Брусиловская Редактор O.филиппова Техред д. дч Заказ 770 1 Гираж 71 Корректор Н.Король ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035 Москва, Ж-35, Рзушская наб., д. 4/5 Подписное филиал.П П атент,.г. жгород, ул, роектная, 3 97 ке с диэтиламинозтилцеллюлозой раз. мером (2,4>15 см) в градиенте аммонийацетатного буфера рН 7,8, скорость 18 мл/ч, объем 3 мл„ Всего получено шесть фракций. Первая, вторая и третья фракции десорбируют из колонки при ступенчатом методе элюции 0,05 М (250 мл), 0,1 М (250 мл), 0,2 М (250 мл), аммонийацетатным буфером рН 7-8. Использование в дальнейшем градиентного метода элюции, начиная от 0,2 М (300 мл) - 0,5 М (200 мл), буФерного раствора рй 7,8 позволяет получить еще три фракции, Высокую кининазную активность удалось обнаружить только в третьей фракции из шести выделенных, Ее удельная активность превысила активность цельного ядя в 10 раз. Электролиз в полиакриламидном геле показал, что третья фракция дает одно пятно, мигрирующее к аноду, что свидетельствует о чистоте выделенного фермента, В результате разделения яда методом гель-фильтрации и ионообменной хроматографии получили гомо генную кининазу с удельной активностью 760 „в количестве мкг экв иг. белка мин. 200 мг. Таким образом, получили фермент кининазы, превосходящий по своей удельной активности известные до сих пор полученные кининазы. По своим свойствам этот фермент также отличается от известных. На основании экспериментальных данных фермент отнесен к кпассу тиоло вых соединений. Оптимальная рН этого фермента 7,8 и она устойчива при рН 6,5-9. Предлагаемый способ позволяет получить фермент с высокой активностью, что дает возможность использовать его в модельных опытах по выяснению свойств и функций отдельных компонен. тов кининовой системы, помогающих скрывать интимные механизмы процесса, происходящих в живом организме, а также правильно понять роль кининаз 10 в патоголических изменениях организма при уксусах пауков. Это даст возможность изыскивать новые лекарственные средства при укусах ядовитых пауков, ! Способ получения кининазы из сыzo рья животного происхождения, включающий гельфильтрацию с последующей злю° цией буферным раствором и ионообменную хроматографию,- о т л и ч а ю " шийся тем, что, с целью повыше25 ния ферментативной активности, в качестве источника сырья используют яд паука Latrodectus tredecinguttatus, который подвергают гельфитрации на сефадексе 6-50 с элюцией зв 0,005 М аммонийацетатным буферным раствором, затем полученную первую фракцию разделяют ионообменной хроматографией на колонке с диэтиламиноэтилцеллюлозой и элюируют фермент аммоний-ацетатным буферным раствором, Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1. Margol1iss J Buce S Release of bradi kinin - like suhs tance 4е (BKIS) in sheep fy renopa of Crotalus аtrox. Austral 1. Ех and eg. Sie v. 43 i Зф 1965.
