Способ изоэлектрического фокусирования белков

 

Союз Советских

Соцнапнстнчесннк .Республик

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТ8У ц9?6365 (61) Дополнительное к авт, саид-ву (22) Заявлено 26. 12.80 (21) 3251332/30-15 с присоединением заявки М (23) Приоритет

Опубликовано 23 11 82 бюллетень М 43 (Sl)N. Кй.

601 Й 27/26

Всуаарстмниьй квинтет

СССР ао делам изобретений н открытий

{53) УДК 599.322. .2.578.088.7 (088.8) Дата опубликования описания 23 11 82

Г. Ю, Ажицкий, Г. В. Троицкий и В. Ф. Петренко (72) Авторы изобретения (71) Заявитель

Крымский медицинский институт (54) СПОСОБ ИЗОЭЛ ЕКТРИЧЕСКОГО

ФОКУСИРОВАНИЯ БЕЛКОВ

Йзобретение относится к электрофорезу в рН градиентах.

Известен способ изофокусирования, основанный на том, что в буферном растворе стандартной прописи создается градиент

5 концентрации органического растворителя и при этом также индуцируется градиент рН (1) Йаиболее близким к предлагаемому 10 является способ изоэлектрического фокусирования, основанный на том, что градиент рН создается градиентом концентрации полиолов в боратном буфере. В стеклянной трубке в среде боратного буфера создается градиент концентрации полиола, например маннита, ксилита, или глицерина.

При этом автоматически образуется градиент рН. Образец белка, растворенный в боратном буфере или диализованный npozo тив боратного буфера, вносится в эту же трубку. К ее обоим концам подключают постоянный электрический ток, под действием которого белок концентрируется в обла с ти своей из оэлек трическ ой точки (2$

Однако для целей концентрирования белков известный способ не применяется, так как эффект концентрирования незначителен вследствие того, что рН градиент распределен по всей длине трубки.

Целью изобретения является повышение степени концентрирования белка при его изофокусировании.

Указанная цель достигается тем, что электрофорез белков проводят и ступенчатом градиенте рН, который формируют путем заполнения колонки боратным буфером с рН 89 — 9,1 на 1/8 — 1/10 объема колонки,. добавления ксилита до концентрации 60 - 70% в боратном буфере и рН

4,0 — 4,2 и заполнения оставшегося объема колонки исходным боратным буфером с пробой белка.

Такой способ концентрации белка применим для 85 — 90% всех известных белков, изоточки которых находятся и диапаФормула изобретения

3 97636 зоне рН 4,0 — 9,0. Так как процесс изо.фокусирования происходит в очень незначительном объеме растворителя, примерно

0,5 мл, следовательно, и степень концентрирования достаточно высока.

Пример 1. Изофокусирование с целью концентрирования смеси белков, со стоящей из 0,01% альбумина и 0,01% гемоглобина, проводили на колонке для иэофокусирования в борат полиольных сис-, 1й темах. Для этого данные белки растворяли до указанной концентрации в 0,01 м борноборатном буфере рН 9,0. Затем в колонку наливали 5,0 мл 60% ксилита, растворенного в этом же буфере, после чего его рН снижалась до 4,0 и затем насосом наслаивали 45 Йл раствора белка. Колонку подключали к источнику постоянного тока,при градиенте потенциала

20 в/см. Опыт проводили в течение 6 ч.

Уже через 30 мнн на границе раздела значений рН набл..одели концентрирование гемоглобина. После окончания опыта окра щенная зона была отобрана в объеме

0, 5 - 0,6 мл. На основании спектрофото-, метрического определения концентрации было показано, что весь внесенный белок

:сконцентрирован, Пример 2. Концентрирование белков мочи. К 50 мл мочи, полученной от больного нефритом, была добавлена бура с целью образования в ней буферного раствора с рН 9,0 и концентрацией 0,01 м.

После этого 45 мл мочи было наслоено на 5,0 мл раствора ксилита, как и при35 мере 1. фокусирование вели в течение

5 4, 1 ч при 10 в/см и в течение йоследующих 6 ч при 20 в/см. Через 7 ч изофо- кусирования опалесцирующий белок был визуально обнаружен на границе раздела рН. Количественный анализ показал, что концентрация до фокусирования была равна 0,001%, а после фокусирования 0,09%. то есть белок был сконцентрирован в, 90 раз. Если для этой цели применить известный способ, то удается повысить концентрацию белка не более чем в 2 раза.

Способ иэоэлектрического фокусирования белков, включающий электрофорез белков в градиенте рН в колонке с боратным буфером, о тл ич а ющийс я тем, что, с целью повышения степенй концентрирования белка, электрофореэ белков проводят в ступенчатом градиенте рН, который формируют путем заполнения колонки боратным буфером с рН

8,9 — 9,1 на 1/8 - 1/10 объема колонки, добавления ксилита l1o концентрации

60 — 70% в боратном буфере и рН 4,04,2 и заполнения оставшегося объема колонки исходным боратным буфером с пробой белка.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Авторское свидетельство СССР

И 442801, кл. А 61 К 27/10, 1972.

2. Доклады АН СССР 1974-, 214, с. 955 - 958.

Составитель Т. Чечеватова

Редактор В. Иванова Техред М. Гергель Корректор У. Пономаренко

Заказ 8996/72 Тираж 887 Подписное

9НИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5 филиал ПГИ! "Патент», г. Ужгооод. ул, Проектная, 4