Способ оценки специфической антиген-связывающей активности антисыворотки
ОП ИСАНИЕ
ИЗОБРЕТЕНИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ
Союз Советских
Социалистических
Республик
51 М Кп з с присоединением заявки ¹A 6.1 К 39/00 Государственный комитет СССР но делам изобретений н открытий (23) Приоритет Опубликовано 150383. Бюллетень Р 10 (53)УДК576 8. 097.2(088.8Р Дата опубликования описания:15.03.83 е! ::": —.-Я.A.Coêîëoâ,.Т.А.Серова, Н.A.Ñ õ îâä: и,;.,ГН.Левки (72) Авторы изобретения Московский научно-исслеиовательскнЧК"и вакцин и сывороток им. И.И.Иечникова (71) Заявитель (54) СПОСОБ ОЦЕНКИ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ АНТИГЕН-СВЯЭЫВАЮЩЕИ АКТИВНОСТИ АНТИСЫВОРОТКИ Изобретение относится к медицине, в частности к прикладной иммунологии, а именно к способам оценки свойств антисывороток против любого рода антигенов, преимущественно к способам оценки их специфической антиген-связывающей активности, и может быть использовано для количественного сравнения сродства антисывороток к родственным антигенам.. Известен способ оценки специфической антиген-связывающей активности антисыворотки к антигену путем приготовления последовательных разведений антисыворотки, добавление нативного и мечено1"о антигена с последующим инкубированием полученных смесей, добавлением второй системы антител, повторнбй инкубацией и определением антиген-связывающей активности антисыворотки по радиоактивности связанногдмеченого антигена. Показателем антиген-связывающей активности при этом служит значение титра антисыворотки, при котором Наблюдают максимальную преципитацию антигена, т.е. Титр, на который, приходится так навываемый пик кривой титрования Гейдельбрегера (13. Однако известный способ недоста5 тОчнО тОчен . Целью изобретения является повышение точности способа. Указанная цель достигается тем, что согласно способу оценки антиген-связывающей активности антисыворотки путем приготовления посчедовательных разведений антисыворотки, добавления нативного и меченогоанти» гена с последующим инкубированием полученных смесей, добавлением второй системы антител, повторной инкубацией и,впределением антиген;связывающей активности антисыворотки по радиоактивности связанного меченого антигена, используют последовательные разведения нескольких серий антисыворотки, иативный антиген добавляют в Ъозрастающях концентрациях от серии к. серии аитисывортЗтки, по постоянноф концентрации для каждой серии и после повторной инкубации определяют антиген-Связывающую активность антисыворотки, З0 которую вычисляют по формуле 1003841 где А - антиген-связывающая активность (концентрация антигена, наличие которой в цельной сыворотке обеспечит 50%-ное снязынание антигена антителами ); - количество серий титрования антисыворотки, отличных по концентрации стандарта нативного антигена, нключая 0концентрацию; С - концентрация нативного анти0- гена в очередной серии титронания, включая концентрацию, равную нулю; ТО - радиоиммунологический титр антисыворотки в очередной . серии титрования включая серию "нуль" (РИА-титр 50%-ному уровню связывания радиомеченого антигена в процентах к максимальному уровню связывания, .равному 100%). О сродстве антисыворотки антигену судят по величине угла наклона f кривой титрованйя в точке радиоиммунологического титра. Алгоритм нахождения половинной точки и угла наклона кривой титрования в этой точке реализован апроксимацией экспериментальной кривой сплайн-функцией третьего порядка на языке "фортран-4" Пример . Проводят оценку антиген-связывающей активности антисыворотки индуцированной к человеческому инсулину и морркой свинки ,Готовят серию разведений исследуемой сыворотки в диапазоне 1:301:3000000 с помощью 0,5 М фосфатного буфера РН 7,5 л 1% альбумина бычьего и 0,3% этилендиаминтетраацетата натрия (буферный раствор 6 1). В первую серию реакционных пробирок вносят по 0,1 мп буферного раствора 9 1, во вторую серию — тот же буферный раствор с концентрацией международного стандарта инсулина в нем 100 мкед/мл, н третью серию - с концентрацией стандарта инсулина 300 мкед/мл, а в четвертую серию— с концентрацией стандарта инсулина 900 мкед/мл . Далее во все пробирки вносят по 0,1 мл раствора инсулина— 125 (0,02 мк/кюри 1 атом йода - 125 на мол пептида) . Инкубацию выполняют 12-24 ч при 4 С. В пробирки вносят по 0,1 мл 1:10 антисыноротки к иммуноглобулинам морской свинки. Вторую инкубацию выполняют 24-Зб ч при .4 С. Пробирки центрифугируют 20 мин при 2000 об/мин, супернатант сливают. Пробирки центрифугируют 20 мин при 2000 об/мин, супернатант сливают. ПРосчитывают. Радиоактинность реакционных пробирок с выделенным преципитатом. На фиг. 1 (а и б ) представлены результаты радиометрии, которые подвергают графической обработке. Угол наклона кривых титронания для точки РИА-титра (радиоиммунологический титр антисыноротки) составляет при этом 25,4-33,0 . Погреш— ность определения значения параметра A составляет 13,5+3,5% (в то время как в прототипе она составляла 240+53%). Таким образом, способ позволяет осуществлять контроль любых антисывороток н полях/мп сняэываемого антиге <а при их производстве и производстве диагностикумов. (PHA-инсулин, PHA-СТГ% соматотропина и пр.), а также повышает точность способа. Формула изобретения Способ оценки специфической антиген-связывающей активности антисыворотки путем приготовления последовательных разведений антисыноротки, добавления нативного и меченого антигена с последующим инкубированием полученных смесей, добанлением второй системы антител, повторной инкубацией и определением антиген-связывающей активности антисыноротки по радиоактивности связанного меченого антигена, о т л и ч а ю щ и и с я тем, что, с целью повышения точности способа, используют последовательные раэнедения нескольких серий антисыворотки нативный антиген добавляют в возрастающих концентрациях от серии к < ррии антисыворотки, по постоянной концентрации для каждой серии и после повторной инкубации определяют антигенсняэывающую активность антисыворотки, которую вычисляют по формуле 1603841 «Руруу (P z c анвисн3фдмки) где A - антиген-связывающая активность (концентрация антигена, наличие которой в цельной сыворотке обеспечит 50% связывание антигена антителами ); — количество серий .титрования антисыворотки, отличных по концентрации стандарта на= тивного антигена, включая 0-концентрацию; С . - концентрация нативного ан0-) тигена в очередной серии титрования, включая концентрацию, равную нулю; Т вЂ” радиоиммунологический титр антисыворотки в очередной серии титрования, включая серию "нуль" (РИА-титр = 50%-ному уровню связывания радиомеченого антигена s процентах к максимальному уровню связывания, равному 100%). Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1. Фримель Х . Иммуйологнческие методы. И., "Мир", 1979, с. 430. 1003841 ( автнай пви) Составитель Г. Крюкова Редактор В. Ковтун Техред С.Мигунова Корректор JI. Бокшан Заказ 1638/4 Тираж 711 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5 филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4
