Способ получения стимулятора антителопродуцентов

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СТИМУЛЯТОРА АНТИТЕЛОПРОДУЦЕНТОВ путем выделения клеток на костного мозга животных с последующим нв1 би роввввем их в питательной среде, концентрированием и элюцией 1 вадосаДочной жидкости, отличающийся тем, что, с пелью повышения выхода целевого продукта и упрощения способа, клетки уялаепяют из костного мозга свиньи, для инкубирования используют клетки в концентрации « 3 .10 на 1 мл питательной среды и инкубирование проводят в течение 1О-24 ч, а элюцию осуществляют нейтральной дистиллированной водой. (Л с

„SU„„1005790

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

А (д) А. 61 К 39/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (2 1 ) 337 9265/28-13 (22) 1 1.01.82 (46) 23.03.83. Бюп. % 11 (7,2) P.Â. Петров, А.A. Михайлова, Л.A. Захарова, E.М. Алферова, P.Н. Степаненко, B.È. Солдатов, А;И. Минаев, 3.П. Сычева, Ю.О. Сергеев и B.È. Нови° ков (53) 612.017.2(088.8) (56) 1. Петров p, В. и др. Изучение природы гуморального фактора костного моз га, стимулирующего продукцию антител., Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 1978, 86, 513-517. (54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СТИМУЛЯТОРА AHTHTEJIOIIPOjLYIIEHTOB путем выделения клеток из костного мозга животных с последующим инкубированием их в питательной среде, концентрированием и элюцией, надосадочной жидкости, о т л и ч а ю ш и и с я тем, что, .с целью повышении выхода целевого продукта и упрощения способа, клетки выделяют нз костного мозга свиньи, для инкубирования. используют клетки в концентрации 3" 103 .101 на 1 мл питательной среды и инкубирование проводят s течение 1О-24 ч, а элюцию осуществляют нейтральной дис- тиллированной водой.

186+20 257+26 . 0 72

3 10ч. 3 19+90 282+47 1,2

142424 7 1+5 2,0

3. 106 (0,05

283+56 120+25 2,36 . (0,05

3 10

240+30 152+15 1, 8 . (0,0 1

3 .10

1 1005

Изобретение относится к медицине в частности к иммунологии, и может быть использовано при получении костномозгового стимулятора антителопродуцентов (САП).

Известен способ получения стимулятора антителопродуцентов путем выделения клеток из костного мозга мышей с по следуюшими инкубированием их в питательной. среде, концентрированием и элюцией надосадочной жидкости (1 ) .Однако известный способ является трудоемким, так как выделение клеток костного мозга и получение препарата САП осушествпяют из трубчатых костей 80-ти мышей при помоши шприца, в результате чего повышается гибель клеток костного мозга и уменьшается выход целевого продукта (10 мг иэ 2 10 клеток), .а кроме того дпя получения САП проводят диа- лиэ, который повышает вымывание части белков, в том числе и САП.

Белью изобретения является повышение выхода. целевого продукта и упрошение способа.

2S

Указанная цель достигается тем, что согласно способу получения стимулятора антителопродуцентов путем выделения клеток йз костного мозга животных инкубируют их в питательной среде, концент.рируют и элюируют надосадочную жидкость, . клетки выделяют .из костного мозга свиньи, для инкубирования используют клетки в концентрации.З ° 10 -3 10 на 1 мл

6 питательной среды и инкубирование проводят в течение 10-24 ч, а элюцию осущест 5 вляют нейтральной дистиллированной водой., Пример. САП выделяют из клеток костного мозга свиньи. При разделы790 2 вании туши свиньи- на мясокомбинате извлекают ребра. Изъятие ребер проводят после нутровки специальным приспособлением, состояшим иэ широкой длинной ручки и металлического ножа, заточенного с двух сторон. Клетки костного. мозга извлекают из ребер путем отжима на прессе с помошью специальной формы.

После отжима и смыва питательной средой клетки костного мозга под вакуумом отсасывают из формы в стерильные фпаконы. Клетки .в концентрации 3" 10 кл/мл

7 инкубируют в среде 199 с. добавлением хепес-буфера (1 М), глютамина (200мМ) . и пенициллина (100 ep) в течение 18 ч . при 37 С и культуральных фпаконах по

О

100-150 мл суспензии на фпакон, объем которого 1. л. Надосадочную жидкость отделяют от клеток центрифугированием, концентрируют в целлофановых мешочках под вентилятором в 1 0 раз и наносят на колонку (3x100 см) с сефадексом С -50, уравновешенную нейтральной дистиллированной водой. Фракции, элюированные в области выхода цитохрома с молекулярной массой 13000 дальтон,, высушивают лиофилизацией, определяют в них. количество белка. по реакции Лоури и либо используют в эксперименте, либо хранят при 4 С. о

Выход САП составляет 80-100 мг из

1 10 ядросодержаших клеток, выделен9 ных иэ одного ребра.

Использование клеток в концентрации

3 10 о или 3 10 и инкубирование их в течение 10 или 24 .ч приводит к аналогичному выходу препарата. Однако оптимальной концентрацией клеток является

3 ° 10 кл/мл (табл. 1 и 2).

Таблица 1

1005790

Табли ца 2

4 206+57 329+1 18 0,7

3 104

4 413+58 423+65

1,0

4 - 319 90 282+47

3 106 1,2

3 10

4 382+82 1 50+22.

2,5 (0.05 3. 10

4 . 158+15 120+15

1,5 (0,05

Оценку активности САП проводят в культуре ин витро и в-системе ин виво по тесту с тимуляции, анти телообразования.

Для определения активности САП в куль, туре ин витро исследуемый препарат в дозе 50-70 мкг и в объеме 0,1 мл добавляют в культуру клеток лимфатических узлов, содержашихся в 1 мл питательной среде в концентрации 1 10 клеток. Лимфатические узлы получают от мышей на четвертые сутки вторичного иммунного ответа к эритроцитам барана. Через 20 ч культивирования определяют число анти- И, телообразуюших клеток (AOK) по реакции

Ерне и сравнивают его с числом АОК в контрольных культурах.

1 .Оценку активности .САП в системе ин ® виво проводят при локальном введении. препарата мышам на четвертые сутки вто ричного. иммунного ответа к эритроци- . там. барана. САП в дозе 100 мкг, со-. держащихся в 0,1 мл питательной среды,,4$ вводят в подушечку задней конечности мыши. В другую «онечность, служившую контролем, вводят питательную среду. На, следуюпнй день у этих мышей извлекают клетки подкопенных лимфатических узлов S0 и определяют в них число АОК, сравни вая их количество в опыте и контроле.

Коэффициент стимуляции антителообразования К в обеих моделях рассчитывают как отношение количества .АОК, приходящихся на 10 ядросодержапнх клеток в опыте, к соответствукшему количеству

АОК в контроле.

САП, полученный данным способом, сохраняет все свои биологические и физико-химические свойства. Он имеет молекулярную массу около 13000 дальтон, в его входят рибонуклеиновая и белковая компоненты. Введение его животным на пике иммунного ответа приводит к аналогичному увеличению количества антитепопродуцентов, как и в известном (.табл.З).

Лиофнлизвция препарата, используемая при предлагаемом способе получения, увеличивает срок его хранения до двух лет.

При ранее известном способе срок хранения САП составлял 3 мес.

Зависимости величины эффекта стиму-. ляции анти тепообразования от концентрации клеток костного мозга свиньи н мыши приведены в табл. 1 и 2 соответственно. Сравнительная характеристика биологической активности костномозгового стимулятора антителопродуцентов (САП), полученного от различных видов животных, и активность САП при разных способах его хранения приведены в табл. 3.

1005790

Клетки костного мозга эмбриона крупного рогатого скота

448+49 280+46 1,6

30. (0,05

САП, выделенный из клеток костного мозга свиньи

358+87 153+43 2,3

80 (0,05

САП свиньи лиофили зованный после пер« вого года хранения

450+78 222+35 2,0

< 0,005

САП, выделенный из клеток костного моз440+39 163+ 18 2,7 (О,OOB га мыши

САП мыши после трех месяцев хранения и растворе

738<224 833+236 0,9

)0,1 с.Ъставитель Г. Крюкова

Редактор H. Йжуган Техред С, Мигунова

Корректор И Шулла;

Заказ 1969/6 Тираж 711. Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб„д. 4/5

Филиал ППП Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Таким образом, предлагаемый способ позволяет получать значитепьно большее количество целевого продукта. Из одного ребра свиньи можно выделить такое,же копичество клеток, сколько из бедренных костей 80 шт. мышей (1-2 109 Я кле- И ток), что значительно удешевляет получе- . ние САП, При выдавливании клеток иэ ребер свиней при помоши пресса затрачивается в 20 раэ меньше времени, чем при вымывании их

as бедренных костей мышей шприцом.

Данная процедура позволяет повысить жизнеспособность культивируемых клеток костного мозга и повысить выход целевого продукта (САП} до 100 мг.