Способ индикации загрязнения объектов окружающей среды химическими веществами

 

1. СПОСОБ ИНДИКАЦИИ ЗАГРЯЗНЕНИЯ ОБЪЕКТОВ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ ХИМИЧЕСКИМИ ВЕЩЕСТВАМИ путем воздействия пробой на гест -культуру микроорганизмов с последующим контролем изменений в культуре, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности и сокращения времени индикации, пробу вводят в один конец протяженной кюветы, содержащей взвесь микроорганизмов, проявляющих эффект хемотаксиса к индицируемым веществам, измеряют перераспределение концентрации микроорганизмов вдоль кюветы и по разности концентрации микроорганизмов в контрюлируемых участках определяют степень загрязнения. (/) С -/3 -/ -/7 -л -ff

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

„„Я0„„1010128

g(5D С 12 Я 1/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ ф -15 -rZ -rr -д

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (2 1) 3276684/28-13 (22) 20.04.81 (46) 07.04.83.. Бюл. N 13 (72) А. В. Пожаров, Н. И. Папутская и B. Ф. Лебедев (71) Ленинградский ордена Ленина электротехнический институт им. B. И. Ульянова (Ленина) (53 ) 61 4.7.002.637 (088.8) (56) 1. Авторское свидетельство СССР

М 557098, кл, С 12 К 1/00, 1974.

2. Патент США И. 3981777, кл. 195-103,5, опублик. 1974.

З.Курносов А. И., Юдин В. B. Технология производства полупроводниковых приборов. Л., 1975.

4. Ляликов Ю.. С. Физико-химические методы анализа. М., Химия, 1974.

5. Кокова В. B. Влияние скорости протока cpBAb1 на плотность, продуктивность, удельную скорость роста культуры Para,ttlQQiUtn COu8atvrn, Питолпгия т. Х1У, N4,,с. 516-522. (54) (57) 1. СПОСОБ ИНЙИКА11ИИ ЗАГРЯЗНЕНИЯ ОБЪЕКТОВ ОКРУЖАЮЩЕЙ

СРЕДЫ ХИМИЧЕСКИМИ ВЕЩЕСТВАМИ путем воздействия пробой на тесзкультуру микроорганизмов с последуюшим контролем изменений в культуре, о тл и ч а ю ш и и с я тем, что, с целью повышения чувствительности и сокращения времени индикации, пробу вводят в один конец протяженной кюветы, содержашей взвесь микроорганизмов, проявляюших эффект хемотаксиса к индицируемым вешествам, измеряют перераспределение концентрации микроорганизмов вдоль кюветы и по разности концентрации микроорганизмов в контролируемых участках определяют степень загрязнения.

3. Способ по пп. 1 и 2, о т л ич а ю ш и и с я тем, что при индикации загрязнения тяжелыми металлами в качестве микроорганизмов используют

101О 128

2. способ по и. 1, о т л и ч а ю - gal0iRPus tnegateriurn к концентрации шийся тем, что перераспределение or 10 до 108 ед./мл. концентрации микроорганизмов по кювете 4, Способ по пп. 1 и 2, о т л и ч аизмеряют фотометрическим методом, ю ш и и с я тем, что при индикации загрязнения объектов окружающей среды газообразными соединениями серы в качестве микроорганизмов используют PocCfgeйюп3 cau3o3tum,в концентрации от 10 до

10 ед. /мл.

Изобретение относится к ох »е окру-: жающей среди, а именно к методам on"". ределения степени загрязненности воды, воздуха, почвы в области промыщпенной и санитарной гигиены, и может быть использовано для токсикологического контроля в пищевой, химико-фармацевтической и других отраслях промышленности.

К веществам, загрязняющим воздух, почву, воду, относятся аммиак, сероводо- 16

° род, соли тяжелых металлов (Cv, 3Чя. Н ) и другие, Известны различные способы определения загрязнений окружающей среды, в том числе с помощью простейших микроорга низмов.

Известен способ оценки токсичности сточных и природных вод, вкл|очающий инкубацию СЫогейо pwr enoidoso3 82 в пробе и определение раэниць3 роста в опыт- 26 ной и контрольной пробах (1).

Наиболее близким к предлагаемому является способ определения загрязнения химическими веществами, о котором судят по уровню токсичности их, заключак 25 щийся в -îì,,что пробу исследуемого материала вводят во взаимодействие с тест-культурой и инокулируют в условиях, поддерживающих хороший их рост (опыт).

Затем Выросшие микроорганизмы отфильт- п» ровывают от жидкости и количество их определяют турбидиметрически. Сравнивают с количеством микроорганизмов, выросших в контроле без исследуемой пробы, и по разнице ростя в опыте и контроле определяют степень токсичности исследуемогоо ма терияла (- ).

Недостатками этого способа являются невысокая чувствительность и длительность проведения анализа, Чувстви тел ьность способа ли3ла, так Kf33. фиэ33ологические процесс:ы клетки хорони> защищены, от неблягоприятных ВолодеAc твпй) по-.

2 этому требуются высокие концентрации токсикантов, чтобы изменить скорость роста микроорганизмов, Время анализа по скорости роста определяется не менее чем двойным временем генерации тест-культуры и достигает .нескольких часов и даже суток.

Целью изобретения является повышение чувствительности и сокращение времени индикации загрязнения объектов окружающей среды.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу индикации загрязнения химическими веществами объектов окружающей среды, заключающемуся в воздействии пробой на тест-культуру микроорганизмов с поСледующим контролем изменений в культуре, пробу вводят в один конец протя>кенной кюветы, заполненной взвесвю микроорганизмов, проявляющих эффект хемотаксиса к индицируемым веществам, измеряют перераспределение концентрации микроорганизмов вдоль кюветы и по разности концентрации микроорганизмов в контролируемых участках определяют степень загрязнения.

Перераспределение концентрации микроорганизмов по кювете обычно измеояют фотометрическим методом.

При индикации загрязнения тяжелыми металлами в качестве микроорганизмов

) обычно используют 53.»» »ИОь п3б с Мг»uп3 в концентрации 10 -10 ед./мл.

6 9

При индикации загрязнения объектов окружаю3цей среды газообразными соединениями серы используют Рс»ге33»3ес»ото

conc(Q+v nn3 в концентрации 1б -1 0 )ед. /мл .

Предлагаемый способ дает возможность реализовать для индикации загрязнений принципиально более чувствительную и быструю по сравнению с известным способом тест-реакцию микрооргяниэмов— хемотаксис направленное движени) МО

28 4 по чувствительности и быстроте извест ного и предлагаемого способов, подтверждают это положение.

В таблице показана чувствительность разных тест-реакций микроорганизмов к химикатам.

7. 10

8 ° 10-.

8 ° 1 0-4

6 ° 10

6.10

3 10

7 10

1О "

10-10

8 ° 10

6 ° 10

6 10

3 10

7. 10

8 ° 10

6.10

0 — 5

3. 10

CvC0 1 2

СоСЕ соьо, 8 10

8 10

6 10

6 ° 10

3 10

FeCB>

"концентрация, необходимая для гибели 50% клеток за 2 ч; концентрация вещества, необходимая для 50% торможения роста клеток за 1 и за 4 сут;

% Ф-% минимальная концентрация вещества, вызывающая хемотаксис, Хемотаксическая реакция имеет место только при разности концентраций химических веществ вдоль кюветы, в противном случае движение микроорганизмов носит хаотичный характер, и они распределены по кювете равномерно. Использование в предлагаемом способе удлиненной кюветы, ввод исследуемой пробы толь46 ко в один ее конец. создает разность KOHцентраций химикатов по длине кюветы, что побуждает микроорганизмы. активно перемешаться в тот конец кюветы, где условия для жизнедеятельности благопри- 4 ятнее. Перераспределение микроорганизмов по кювете можно измерить фотометрическим, кондуктометрическим или другими методами. Расстояние, на котором возможно выявить перераспределение концентраций микроорганизмов, определяется техническими характеристиками соответствующих измерительных устройств и размерами микроорганизмов и составляет около 2 мм. Это расстояние бакте- 55 рии могут пройти за 180 с (3), Рагатеcium caudattum aa 0,8с (4» за счет диффуейи вещества из пробы проникнут во

3 101О1 под действием химических веществ.Чувствительность и быстрота этой тест-реакции связана с тем, что взаимодействие клетки с химикатами происходит на рецепторном уровне на поверхности клетки.

Сравнительные экспериментальные данные взвесь микроорганизмов на расстояние

2 мм за 10 с (рассчитано по уровнению нестационарной диффузии из ограниченного объема по самым быстрым ионам). Следовательно, микроорганизмы во всех известных случаях могут покидать зону введения пробы быстрее, чем идет диффузия. Таким образом, необходимо всего от 0,8 до 180 с для получения в кювете с участка с достаточно выраженной для измерения разностью кои. центраций микроорганизмов. Этим време нем и определяется скорость индикаци по предлагаемому способу.

При реализации способа можно применять все микроорганизмы, обладаккцие эффектом хемотаксиса к индипируемым веществам. В каждом конкретном случае можно выбрать тот микроорганизм, который дает наибольший положител,ьный эффект способа. Большое разнообразие микроорганизмов и их избирательность реак ции на определенные вещества дает возможность утверждать, что при решении задачи индикации определенного вещества .можно выбрать подходящую культуру.

10101 кроме PQI dmge,iom caodatorq метод апро- бирован на культурах QI3fqg9os р)Ъ11 Н, бос1Им megaterIom, 5evra< 1пагseduces, РЮ1еоь х1 ср гls)Хля всех исследованных культур выявлена возможность индикации химическог"o загрязнения по предлагаемому способу, Предлагаемый способ реализуется следующим образом.

Готовят для анализа пробу в жидкости, 10 индифферентной для используемых микроорганизмов и не вызывающей у их хемотаксиса, Водную пробу разводят при необходим Ос ти до конце н трации, не вызы вяющей гибели тест-культуры, из почвы делают вытяжку и при необходимости ее разводят; анализируемый возду, барботируют через жидкость. Готовят ствндарп ную взвесь микроорганизмов, в среде, поддерживающей подвижность клеток в те- „20 чение времени индикации, например воде, физиологическом растворе, причем используют подвижные микроорганизмы, обладающие эффектом хематоксиса к индицируемым веществам (водоросли, про- 25 стейшие бактерии). Заполняют мерно, с тандвртн ой взвесью тест-кул ьту ры. удлиненную кювету, в один ее конец вносят индицируемую пробу в количестве 1/201/5 от объема взвеси. Затем контролиру- З0 ют Изменение концентрации микроорганизмов в нескольких участках кюветы фотометрическим, кондуктометрическим или другими методами от момента ввода пробы и до окончания индикации, которое

35 определяется интенсивностью хемотаксического процесса, природой химических веществ и скоростью движения используемых индикаторных микроорганизмов. Измерение ведут непрерывно или дискрет40 но и по разности концентрации микроорганизмов по алине кюветы оценивают степень загрязнения. Отсутствует необходимость в измерении абсолютного значения концентрации, достаточно испсдьзовять

45 косвенные параметры, характеризующие величину концентрации микроорганизмов, например оптическую плотность, электро-. проводность и т, и, Ня фиг. 1 показана зввисимосгь вели50 чинЫ хемотаксической реакции (аЗ ) от концентрации иолов 1-1 2 (С моль/л);

HQ фиг. 2 — зависимость вели ины хемОтвксической реакции (Q 3 ) о1 концентрации ионов сР- (C моль, л); ня фиг. 3 зависимость величины хемо такс и че с кой реакции(rI 1 ) От времени (+ ) цри дейст-. вии иОИОВ 11 Q В концентрации 2 . 1 0

+ Я моль/л; ня фнг, -1 — зяВисимос ть В»личи28 6 ны хемотаксической реакции (ДЭ ) от

-2 времени (4 ) при,действии ионов d в

I концентрации 1 10 моль/л; на фиг, 5 зависимость хемотаксической реакции (, d3 ), a от времени при разных концен рациях МН и (б ) от концентрации М11 зв 30 мнн воздействия; на фиг. 6 — зависимость величины хемотаксической реакции (.ЛЗ ) от времени воздействия химического вешества1 (a -М1 о-Сц )от кон 2+ 2+1

2+, цен тряции химического вешес твя (9-Hl

Ъ- (A + ) за 30 мин воздействия.

Пример 1- Проводят индикацию ионов Hq;, g > соответствующие внион

+2 и катион которых хемотяксиса у тесткультуры не вызывают, что предварительно проверено экспериментально, Исследуемые концентрации испытуемых ионов готовят в среде .Лозина-Лозинского следующего состава, г/л:

NаCl? 1" 10

КСМ 1, 10-4

M@S04

1 10

СяС8 в 1 10

Я â 1С0

2 10

«4

Тест-культуру Pprameciutn саода1вт

I выращивают по методике (5), отмывают от дрожжей средой Лозина-Лозинского на центрифуге (3000 об/мин, 5 мин) > вносят В стеклянную кювету размерами

70 10 ° 5 мм в количестве 3 мл, причем используют взвесь микроорганизмов с концентрацией 3000 клеток в 1 мл.

В ту же кювету в один ее конец вносят индицируемое вещество в количестве

0,3 мл. Измеряют перераспределение концентрации РЙШнмс10Гп CaodAtom вдоль кюветы под действием пробы фотометрическим методом в двух участках кюветы для чего используют двв фотоприемника, помещенных: первый — нв 26 мм от места ввода пробы, второй — ня 52 мм. Измерение ведут с момента авода пробы в течение 30 мин с интервалами в 5 мин, Степень загрязнения оценивают по разности сигналов (д 3 ) от первого (3„) и второго (3 ) фотоприемников, так KBK в»вЂ” личина сигнала пропорциональна концентрации микроорганизмов в контролируемых участках. Знак величины 33 харвктеризуе т пол ожи тельное или отриця тельное направление хемотаксической реакции, Р»зультаты индикации ионов Hq, 5 показаны нв фиг. 1-4.

Порог чувствительности способа: для иона Haj+ 2 10 моль/л (фиг.1 ); для иона 5 1 10 моль/л (фиг. - ).

Величина хемотаксической реакции проПОРЦИОНВЛЬНВ КОНЦЕНтРаЦИИ ХИМИНЕСКИХ.7 10101 веществ в широком i диапазоне последних, i а именно: для Н 2 от 2. 1б%о 2 10 моль/л; (фиг. 1)", для g от 1- 10 до 1 10 моль/л. s (фиг. 2).

Величина ДЗ достигает значения, под6аюшегося измерению предлагаемым способом, через 2-5 мин и возрастает в тече- . ние всего времени индикации (ЗО мин в . 10 данном примере) (фиг. 3 и 4). Для Н 3 (3

+2 величина а3 отрицательна, микроорганизмы уходят от места ввода пробы — отрицательный хемотаксис (фиг. 1 и 3).

Для иона5 313 величина аЗ положи- IS

-2 .1 2 тельна, микроорганизмы остаются> соби- раются к месту ввода пробы, т.е. имеег место положительный хемотаксис (фиг. 2 и 4).

Пример 2. Индикация загрязне- 20 ния пробы воздуха.

Часто встречающимся загрязнением воздуха является аммиак, поэтому моде-t лируют загрязнение воздуха этим веществом. Готовят. смесь воздуха с аммиаком. 25

Смесь барботируют через дистиллированную воду в течение 15 мин. Определяют концентрацию аммиака в воде по стандартной методике (метод Несслера). Рабочие растворы с известной концентрацией ам- щ миака готовят в среде Лозина- Чоэинско го разбавлением до исследуемой концентрации. Llanee согласно способу проводят испытайие по методике, данной в примере

1. Исследуют растворы аммиака в диапазоне концентраций 1,7 10 — 1,7 х

35 к10 2 Моп «

Большая концентрация (1,7 10 моль/л) вызвала гибель культуры Paramecium cau.8atum поэтому предлагаемым способом не

40 определялась. Пробы с концентрациями аммиака 1,7- 10 и 1,7 ° 10 2 вызывают

--3

28 8 отрицательную хемотаксическую реакцию, а с концентрацией аммидка 1,7 ° 10 о1,7- 10 положительную; хемотакси1 ческую реакцию, величины которых определяют предлагаемым способом по разности концентрации микроорганизмов по длине кюветы (по оптической,плотностиa3 f.

Данные экспериментов представлены на графиках фиг. 5.

Пример З Определение ионов 8> и Cv в почве.

Почву моделируют отмытым песком.

Песок смешивают . с навесками солей никеля и меди. Навески солей берут исходя из их растворимости в дистиллированной воде. Смесь песка и соли помещают в дистиллированную воду известного объема и все перемешивают. Раствор соли сливают и готовят рабочие растворы со лей известной концентрации в среде Лозина Лозинского. Палее испытание проводят по методике, данной в примере 1.

Результаты индикации представлены на графиках фиг. 6.

Таким образом, испытания показали, что предлагаемый способ обладает высокой чувствительностью (на несколько порядков выше прототипа) и сокращает время индикации с нескольких часов до минут. Аналогичные результаты по чувствительности и скорости индикации предлагаемым способом получены и на других индицируемых объектах из воды, воздуха, почвы, Кроме того, предлагаемый способ дает воэможность расширить круг индицируемых вешеств за счет использования набора тест-культур, а также за счет использования как положительного, так и отрицательного эффекта хемотаксиса.

1010128

1010128

1010128 фГ/49/

30 д г лэг

-aI м4

g 7 Ф 5 Ф ?il

8, сии

-У гф

Фа lugb 10

fg д; щ

М

/ д г щ и -Ф

-5Р б

O Ги <сап

> г

-7Р

-яХ,мА г

Ю

-dg Óè4

Заказ 2 408/ 1 3 Тираж 52 1 П одни : ное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР но делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Составитель О. Скородумова

Редактор М, Петрто Техред M. Коштура Корректор М. Шароши