Способ определения содержания гидроперекисей липидов в плазме крови

 

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ ГИДРОПЕРЕКИСЕЙ ЛИПИДОВ В ПЛАЗМЕ КРОВИ путем экстракции их гептанизопрогганольной смесью с последующим измерением оптической плотности гептановой фракции в диапазоне 232234 им, отличающийс я тем, что, с целью повышения чувствитель ности и ускорения способа, к образцу плазмы крови добавляют 15-25-кратное количество гептан-изопропанЬльной смеси в соотношении 1:1, а после экстракции в смесь вносят 1/10-1/7 объемную часть раствора соляной кислоты при рН 1-2.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

° ЗСЮС Ol N 33 48

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н AB ГОРСКОМУ CWPqTalt СТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3328887/28-13 (22) 31 ° 07.81 (46) 15.05.83. Бюл, М 18 (72) В.Б.Гаврилов и М.И. Мишкорудная (71) Белорусский научно-исследовательский институт кардиологии (53) 612 ° 11.12 (088.8) (56) 1. Владимиров (0.A., Арчанов A.È.

Перекисное окисление липидов в биологических мембранных. М ., Наука, 1972.

2. Z. Potager Spectrofotometricae

estimation of I?ipid pегоxide in tissue, Ana9yticae Biochemistry, 1966, 16, 359-364.

„„SU„„1018014 A (54) (57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ ГИДРОПЕРЕКИСЕИ ЛИПИДОВ В ПЛАЗМЕ

КРОВИ путем экстракции их гептанизопропанольной смесью с последующим измерением оптической плотности гептановой фракции в диапазоне 232234 нм, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствитель» ности и ускорения способа, к образцу плазмы крови добавляют 15-25-кратное количество гептан-изопропанольной смеси в соотношении 1:1, а после экстракции в смесь вносят 1/10-1/7 объемную часть раствора соляной кислоты при рН 1-2.

10180 4

)л 3 06 pFатение ОтнОситс я к медицина; а им нно к клинической биохимии, Нзнестен способ определения кон— центрации гидроперекисей липидов в биологича ких тканях, основанный на регистрац и ультрафиолетового (УФ) поглощен%я липидных "=êñ;-рактов в области 232-234 нм, которое coorserствует интенсивному максимуму погло— щения кокькгиронанных диеноных структур полиненасыщенных гидроперакисей липидон (1) .

Однако данньй метод доволь;-.о трудоемок и предназначен для научных исследований, где необходима максималько возможная экстргкция гидроперекисей липидон . Реализация 0!! особа требует сложного биохимическoгo оборудования: специальной химической посуды,. poтopaoro испарителя или системы для уг аринания н тока инерт.— ного газа..

Наиб Олее бли зк им к предла Га емОму является способ определения гидроперекиcåé липидов н биологических тканях,. согласно которому к 1 г ткани или 1 мл плазмы крови добан— ляют 10 мл гептан-изопропанольной смеси. Полученную смесь встряхивают, центрифугируют и отбирают супернатант. К супернатанту добавляют 1/10 объемную часть воды z после расслаи.вания гептан-водно- изопропанольной смеси отбирают гептановый слой.Концентрацию глдроперекисей определяют по пОглОщению В ептанОЭОЙ фракции, Эт Îт с.";особ более прос т, IBê,ê ак исключает до-ia.iнительную операцию перевода липидов ив хлороформ — ме" аноль=" ного экстракта. " =ei тан-метанольную фазу и не требует биохимического оборудования для упаривания липицных экстрактов (2), Однако спос-(П.-|ацера имеет ряд существенных недос гаткон;. требует большого:;.сличает:-а плазмы крови; экстракц»я гидроперекисай липидов происходит не полностью; при р àýäåлении фаз после добавления воды к гептан — изогропанольному раствору ли5Î пидов наблюдается образонанис мутной водно-иэопропанольной фазы (н ряде случаев слабая мутность регистрируется и н гептановом с ое!,. Kpo :å то о,, метод включ-е-.,иного операций .

Г5

Целью изобретения являетc>:. Повыше — - ние чунстнительнос..и и ускорение спо-. с Оба, укаэанная цель достигается -e:i,. что согласно способу определения содержания гидроперекисей липидов 60 в плазме крови г. утем экстракиии их гептан-изопропанольной смеськ с последующим измерением оптической плотности гептановой фракции в диапазоне 232-234 нм, к образцу плазмы крови добавляют 15-25-кратное количество гептан — изопропанольной смеси в соотношении 1:1, а после экстракции н смесь вносят 1/10-1/7 объемную часть раствора соляной кислоты гри рН 1 — 2.

К О, 2 мл пл азмы крови, содержащей мг/мл ЭДТА в качестве антикоагулянта и антиоксиданта, добавляют

4 мл гептан-изопропанольной смеси

,1:1). Интенсивно встряхивают в течение 5-10 мин. Определено, что это время достаточно для полной экстракции гидрогарекисей липидов предлагаемым способом. Затем добавляют 1 мл раствора HCP с рН 1-2 и 2 мл гептана. Встряхивают 30 — 60 с. После расслоения гептан-водно-изопропанольной смеси ".е менее чем через 20 мин отстаивания образца отбирают гептачовый -лой и измеряют оптическую плотность при 233 нм (Д 2>>) на серийном спектрофотометре. В качестве контрольной гробы используют образец, содержащий нместo плазмы О, 2 мл воды и подвергнутый всем перечисленным процедурам. Величина Д 233, обуслов— ленная содержанием гидроперекисей .—,ипидов, равна разности между значениями Д 233 ОпытнОЙ и КОнтрОльнОЙ пРОб

Д (гидроперекиси липидон) = Д

233 (ойыт) — Д (контроль) . 2 33

Пример 1. Обследован практически здоровый мужчина С., 50 лет, напранленный на профилактический осмотр в рамках эпидемиологического кардиологического обследования. После исследования плазмы крови предлаi-аемым способом получено значение

Д233 = 0,09 или Д233/мл = 1,84.

П р и и е р 2. Больной К., мужчина 46 лет, поступил в клинику с диагнозом хроническая ишемическая болезнь сердца,. стенокардия напряжения, атеросклероз аорты и венечных артерий сердца. После обследования больного предлагаемым способом получено значение Д 23>--0,. 165 или Д2 /мл=

:-3„3, Всего предлагаемым способом было обследовано 10 здоровых и 12 больных хронической ишемической болезнью сердца (ИБО) мужчин н возрасте 40

59 лет .

В норме среднее значение концентрации гидроперекисей липидов в плазме крови было равно Д /мл 1, 42+

233

10,50, à „ or!i H HEC этот показатель был н 1,4 раза выше и равнялся

Д -.y мл=2,05+0,60, увеличение степени экстракции гид.роперекисей липидон в основном зависит от величины рН водной фазы и .максимально н диапазоне рН 1-2, н котором экстракция гидроперекисей липидсв на 45-55 выше исходного уровн я (таблица), 1018014

T рН водной фазы j 7 б. 5 4 3 2 1 0,9

Д2 32 гептанового экстракта 0 095 0 112 0,112

0,112 0,125 0,145 0,140 0,139 1232 + 0,002

/Дмин

100

118 118

132 153 147 146

118!

Составитель С. Котелевцев

Редактор И.Бандура Техред О. Неце Корректор.М. лароши

Заказ 3529/42 Тираж 873 Подписное

BHHHIIH Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Ъ

Предлагаемый ° способ может применяться при массовых клинических исследованиях при изучении заболеваний, сопровождающихся повышением интенсивности перекисного окисления липидов

Предлагаеьый способ определения гидроперекисей липидов в плазме крови по сравнению с существующим способом Плацера имеет следующие преимуществаг требует в 5 раэ меньшее количество плазмы крови упрощает исследование, так как не нуждается в использовании центрифугирования g улучшает разделение гептановой н водно-изопропанольной фаз и увеличивает зкстракцию гидропефекнсей липидов по сравнению с известным методом за счет относительного увеличения объема экстрагирующей смеси и изменения рР. водной фазы.