Способ количественного определения стероидных гормонов в биологических субстратах
СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТЕРОИДНЫХ ГОРМОНОВ-В БИОЛОГИЧЕСКИХ СУБСТРАТАХ, включашвий проведение экстракции исследуемого субстрата и количественное биохимическое измерение содержания стероид ных гормонов, отличающийс я тем, что, с целью снижения трудоемкости способа путем одновременного определения эстрадиола г 17р, эстрона и эстриола в одной пробе и повышения точности, экстракцию проводят с помощью смеси спиртов с последующим пропусканием полученного продукта через целитовую колонку, проводят гидролиз полученного экстракта , очищают полученный тидролизат и затем разделяют искомые стерои ды с помощью адсорбционной хроматографии на микроколонке из . распределительной хроматографии, . после чего проводят их количественное биохимическое измерение. (Л
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
C0UNVNOI
РЕСПУБЛИК
„,SU„„1012138 A )(59, G 01 Н 33 48
hj с
OllHCAHHE HSOBPETEHHR нввтовсномв свисвтвъствт
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР
llO ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТКОЙ, (21) 3216887/30-15 (22) 12.12.80 (46) 15.04.83. Бюл. В 14 (72) Л.Ф. Адигамов (71) Институт питания АМН СССР (53) 612.621.31(088.8) (56). 1. Авторское свидетельство СССР в 288867, кл. G 01 N 33/48, 1971.
2. Авторское свидетельство СССР
9 438928, кл. G Ol N 33/48, 1974.
3. Патент Франции В 2396975, кл. О 01 В 33/16, 1979. (54) (57) СПОСОБ КОЛИЧЕС1ВЕННОГО ОПРЕцЕЛЕНИЯ СТЕРОИД(ЫХ ГОРМОНОВ. В
БИОЛОГИЧЕСКИХ СУБС1РАТАХ, включающий проведение экстракции исследуемого субстрата и количественное биохимическое измерение содержания стероидных гормонов, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью снижения трудоемкости способа путем одновременного определения эстрадиола .- 17/ эстрона и эстриола в одной пробе и повышения точности, экстракцию проводят с помощью смеси спиртов с по.следукщим пропусканием полученного продукта через целнтовую колонку, проводят гидролиз полученного экстракта, очищают полученный гидролизат и затем разделяют искомые стероиды с помощью адсорбционной хроматографии на микроколонке из AQO 3 и распределительной хроматограФии, после чего проводят их количественноеЯ биохимическое измерение.
1012138
Изобретение относится к способам определения стероидных гормонов.
Известны способы раздельного определения зкстрадиола-17Р, тестостерона и др. $ 11 н f 2).
Однако известные способы не пОзволяют вести одновременное определение нескольких стероидных гормонов в одной пробе.
Известен также способ одновремен" ного определения гормонов в пробе, 10 включакщнй экстракцню субстрата, очистку получаемого экстракта и последующее биохимическое измерение содержания гормонов (3 .
Однако этот метод трудоемок, не 15 достаточно точен, не позволяет вести определение связанных Форм стероидов.
Целью изобретения является снижение трудоемкости способа путем одновременного определения эстрадиола-lgg20 эстрона и этриола в одной пробе и повышение точности способа.
Цель достигается тем, что соглас.но способу количественного определения стероидных гормонов в биологических субстратах, включающему проведение экстракции исследуемого субстрата и количественное биохимическое измерение содержания стероидных гормонов, экстракцию проводят с помощью смеси спиртов с последующим пропусканием полученного продукта через целитовую колонку, проводят гидролиз полученного экстракта гидролизата и последующее разделение. искомых стерЖ дов с помощью адсорбционной„хроматографии на микроколон" ке из А1 0ь и распределительной, хроматографии, после чего осуществляют их количественное биохимическое измерение. 40
Пример . Экстракцию из тканей животных (мышц, печени, почек и др.) проводят в 2 этапа. Сначала тщательно измельченную ткань (150200 r) экстрагируют в скоростном смесителе смесью полярных растворителей: этанол-метанол-вода (1:1:0,6)
300-400 мл. Остатки ткани отделяют фильтрованием через бумажный фильтр, фильтраты объединяют (1 этап). Затем тканевые остатки смешивают с целитом (1)-3 веса ткани) и смесь переносят на колонку (используют колонку размером Зх30 см). В колонку вносят экстрагентв этанол-метанол (1:1) и экстрагируют в течение 910 ч (П этап экстракции). Экстракты объединяют и концентрируют на роторном испарителе до объема 100150 мл. Выпавший осадок отделяют фильтрованием и отбрасывают.
Кислотный гидролиз. К экстракту добавляют соляную кислоту до концентрации 12% и гидролизуют 30 мин при
75 С. К гидролизату добавляют 2 объема дистиллированной воды, добавлением65
2н.NaOH доводят рН до 5,5 и дважды экстрагируют равным объемом эфира.
Эфирные экстракты объединяют, фильтруют через Na SO4 и выпаривают в вакууме досуха.
Хроматографнрование на колонке
АЛОЭ. Перед хроматографией А) ОЬ обезвоживают (при 180 в течение 4 Ч) затеи адсорбент стандартизируют до-бавлением 10% воды и встряхивают в течение 2 ч, Al 1эстриол). Фракции, содержащие эстро- гены, выпаривают на роторном исйарителе до минимального объема Экстракция смесью полярных растворителейз этанол-метанолвода (1з l! 0,6) Ф . Гидролиз кислотный или ферментный Ь Хроматография на колонке А1 0ъ 1 Хроматография в тонком слое силикагеля ГЖХ Флюорометрия Радиоиммунологическое определение, Метод одновременного определения эстрадиола-17Pg эстрона и эстриола в тканях животных проводят по следующей схеме. Хроматография в тонком слое сили" кагеля. Исследуемую пробу наносят на пластину силикагеля (20х20 см, толщина слоя 0,4 мм). Пластины пред- варительно активируют 50 мин, при 120 . TCX проводят в системе растворителейг бензол-этилацетат (2 .3). Элюцию с тонкого слоя осуществляют смесью растворителей: этанол-бензол (3:l). Элюаты выпаривают на роторной испарителе. Количественное измерение. Предлагается 3 метода количественного измерения, каждый из которых с успе хом может быть применен в зависимос ти от конкретных условий. Флюорометрический метод наиболее доступен: измерение флюоресценции проводят иа спектрофлюорометре (любой марки) или же на отечественном флюорометре типа СКБ с интерференционными светофильтрами. Для получения флюоресцирукщих производных сухие остатки, соответствующие каж- 1012138 Составитель A. Макаров Техред Т. Фанта Корректор О. Билак Редактор М. Товтин М Заказ 2751/54. Тираж 871 Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д, 4/5 Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 дому из исследованных стероидов„ растворяют в 0,3 мл этанола и добав,. ляют 1,5 мл реагента 96% зтанолконцентрированная серная кислота (ls4) и прогревают в течение 5 мин при 60© у смесь охлаждают и выдерживают 40 мин при комнатной температуре. Затем измеряют флворесценцию. . Максимум флюоресценции для эстрона,. эстрадиола-17 и эстриола при 500-520 нм Я 475-495 нм)., Чувствивельность метода 0,040,08 мкг (для каждого sss зстрогенов), ГЖХ способ количественного измерения основан на исследовании фтор производных стероидов (детектор эле ктронного захвата). Для получения фторпроизводных, сухой остаток, соответствующий эстрону или эстрадиолу, растворяют в 0,5 мл бензола и добавляют 2 капли гептафтормасляного ангидрида .смесь прогревают при .70 в течение 40 мин и высушивавт под струей азота.При фторировании от каждого иэ эстрогенов получают несколько фторпроиэводных. Применение тонкослойной хроматографии на силикагеле позволяет -выделить дигептафторбутираты.стероидов, которые в дальнейшем измеряют методом ГЖХ. Тонкослойную хроматографию (двумерную) проводят в системах растворителей: беэол-метиленхлорид-этнлацетат 2:1:1 и 1:1:2. При проведении,ГЖХ (хроматограф Цвет-1063 s качестве жидкой фазы используют ЗВ SE-30> нанесенную на хроматон, применяют стеклянные колонки — 2 м Т„ э»» о 200 Т weaapsrre w 230 t Тдетэктдуп о е Ь 5 240 . В этих условиях время удерживания эстрона.равно 8,2 мин, эстра ;диола — 7,6 мин. ГЖХ анализ фторцроизводных позволяет определить О,l«1,0 кг эстрогена..В связи с тем, О,что эстриол дает большое число фтор,производных (что затрудняет коли:чественное измерение) данный метоД :мы рекомендуем s основном для.эстрона и эстрадиола. 15 Редиоимаунологический способ коли» ! чественного определения основан на использовании радиоиммунологических наборов (фирмы СЕЛ-1РЕ-ЗОВИ и др.) после изложенной выше очистки экст20 рактов тканей. Метод позволяет определить 10-100 pg стероидов, Варианты использования метода. Метод предназначен для определения основных биологически активных эстр 25 генов в тканях животных. Предлагаемые способы очистки и количественного измерения могут быть использованы также при исследовании эстрогенов в биологических жидкостях. При этом экстракция неконьюгированных зстрогенов проводится с применением общепринятого зкстрагента - эфира (2х3 объема).
