Способ определения содержания живых микроорганизмов

 

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ ЖИВЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ в исследуемом образце, предусмвтрк&акядий приготовление суспензии микроорганизмов в водной среде, отличающийс я тем, что, с целью ускорения и упроще НИН способа, суспензию микроорганизмов окрашивсиот красителем на мертвые клетки, ведут..подсчет окрашенный мертвых клеток, затем суспензию инактивируют путем нагрева при 70-100 с в . течение 0,5-5 мин или путем химической обработки, после чего ведут подсчет общего кэличества окрашенных мертвых клеток и по разнице двух пбщсчетов определяют содержание живых клеток в суспензии. (Л С

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИН

09) (И) М5)) С 12 N 1 00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ABT0PCROMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3293587/28-.13 (22) 28 ° 05.81, (46) Z3.05.83. Бюл. 9 19 (72) В. Х.Тихонов, A.H.Èåçeíöåâ, В.Л.Земляков и Н.В.Цветкова (71) Всесоюзный научно"исследовательский институт биологического приборостроения (53) -576.8.093.6(088.8) (56) 1. Практикум по микробиологии.

Под ред. Н.С.егоpoaa. Изд-во МГУ, 1976, с. 61-65. .2, Strugger S °, Fluorezenzmikroskopie цпй Nikrobiologie.. Verlag И.Н.Schaper, Hannover, 1949, с. 101113 °

3. Пешков Н.A. Цитологкя бактерий.

1955, с. 20ч (54) (57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖА

НИЯ ЖИВЫХ МИКРООРРАНИЗМОВ s исследуемом образце, предусметривающый приго" товление суспенэии микроорганизмов в водной среде, отличающийся тем, что, с целью ускорения и упроще ния способа, суспенэию микроорханиэмов -окрашивают красителем на мертвые клетки, ведут.:подсчет окрашеннык мертвых клеток, затем суспензию инактивкруют путем нагрева прк 70-100 С в течение 0,5-5 мин или химической обработки, после чего ведут подсчет общего квличества окрашенных мертвых клеток и па разнице двух подсчетов определяют содержание киных клеток в суспензии. В

;101ВН0

Изобретение относится к микробно- 70"100"С в течение 0,5-5 мин или пу огии, в частности к методам опреде" тем химической обработки., после чего ления живых микроорганизмов, и может ведут подсчет общего количества окрабыть использовано в микробиологичес- шенных мертвых клеток и по разнице кой промышленности. двух подсчетов определяют содержание

Известен способ определения числа 5 живых клеток в суспенэии. живых микроорганизмов путем высева Сущность способа заключается в на питательные среды с подсчетом чис" следующих операциях: добавление к ла выросших колоний (1). суспензии красителя, окраска в тече=

Недостатками данного способа явля- ние 3-5 мин, приготовление мазка для ются длительность, составляющая от 10 . счета мертвых клеток, инактивация одного до нескольких дней, и обяза" суспенэии, содержащей краситель, в тельное условие соответствия состава течение 0,5-10 мин, приготовление дреды потребностям определяемых мик- второго мазка для счета общего колироорганизмов, что трудно выполнимц чества клеток, счет клеток в двух при определении смешанных популяций )5 препаратах. микроорганизмов из ферментеров и объ- Одним из наиболее универсальных и ектов окружающей среды. удобных в работе красителей на мертИэвестен способ определения живых зые клетки является флуорохром примуи мертвых бактерий путем окраски об- лин, окрашивающий клетки различных разца красителем акридиновым оранже- 20 классов микроорганизмов . 1лертвые клетвым и подсчета числа бактерий, светя- ки дрожжей хорошо окрашивак>тся также щихся красным (мертвые) и зеленым флоурохромом тиазиновьм красным и аб(живые) светом (2). сорбционным красителем метиленовым

Недостатком этого способа является синим. неоднозначность результатов, обуслов- Оптимальным режимом тепловой инак(ленная, в частности, наличием в про- тивации является нагрев суспенэии при

,бах инактлвированных клеток, сохраня- 70100 С в течение 0,5-5 мин (фиг. 1 кщих ядерный компонент, которые окра- И 2)..Применение более низкс>й темпера шиваются красителем в зеленый цвет. туры, более короткого,и в ряде случаев

Наиболее близким по технической более длительного нагрева приводит к .сущности и достигаемому эффекту яв- З0 уменьшению степени окраски клеток. ляется способ определения содержания При этом хорошее прокрашивание инакживых микроорганизмов в исследуемом тивированных клеток, отмечалось для образце микроорганизмов, предусматри-, всех трех перечисленных красителей, вающий приготовление суспензии микро- причем окрашенные клетки хорошо видорганизмов в водной среде.. 35 ны как в препаратах мазков, так и

Спссоб состоит из следующих oIIepa- " раздавленной-капли . ций мазок бактерий подсушивают на Инактивация путем нагрева удобна воздухе, фиксируют в фиксаторе Кар- тем, что при небольшом времени нагренуа 20 мин, после чего снова подсуши- ва практически не меняется объем клеаают на воздухе не менее 1 ч. Подсу- 40 точной суспензии, что облеучает расшениый мазок окрашивают азур-зозчном чет количества живых клеток .о нри 29 .С в течение 24 ч, затем промы- Примером химической инактивации

Вают в дистиллированной воде, подсу- . может служить обработка фенолом, коШивают на воздухе 5-10 мин, докраши- торая дает наилучшие результаты при вают раствором крас теля светлого зе- концентрации фенола б-12% (фиг, 3) ,леного 1 мин, затем удаляют остатки причем достаточно даже 30-секундной краски, подсушивают и микроскопируют.. обработки (фиг. 4). Обработка меньшиЖивые клетки бактерий окрашиваются ми и болыаими концентрациями фенола в сине-фиолетовый цвет, .а мертвые приводит к ослабленной окраске клеклетки приобретают ярко"зеленУю ок" ток, кроме того, обработка большими раску (3). концентрациями фенола в случае примеНедостатками известного способа нения флуорохромс в ведет к повышению .являются большая трудоемкость и дли- люминесценции фона. Обработка фенолом тельнасть (более 26 ч). путем добавления спиртового раствора о целью изобретения является ускоре" или водной эмульсии приводит к хороше".. ние и упрощение способа. му окрашиванию клеток примулином и

Поставленная цель достигается тем, метиленовым синим (фиг. 3).. После обчто согласно способу определения со- работки фенолом можно готовить для держания живых микроорганизмов в ис- счета как препараты сухих мазков, так . следуемом образце, предусматривающем и раздавленной капли . приготовление суспензии микроорганиз"60 Инактивацию можно проводить и друмов в.водной среде, суспензию микро- . гимн дезинфектантами, например спирорганизмов окрашивакт красителем íà . том, мертвые клетки, ведут подсчет окра- Инактивацию путем добавления жид шенных мертвых клеток, затем суспен- кого химагента предпочтительнее прозию инактивируют путем нагрева IIpH 65 водить в тех случаях, когда по раэ1018970 личчым причинам нежелательна тепловая инактивация ..в случае определения термофильных микроорганизмов, при наличии в пробе низкокипящих приме сей и теде

Инактивация клеток в присутствии 5 красителей имеет следующие преимущест ва перед инактивацией неокрашенных клетокг она более экономична (требуется всего одна суспензия) и более удобна:для автоматизации. способ осуществим для различных .видов микроорганизмов: представителей энетероб@ктерий,, грамотрицатель.иых езробиых хемогетеротрофов, кокков,. бацилл, дрожжей ° 15

; После инактивации в предложенных режимах клетки всех:исследованньи микроорганизмов сохраняли размер и . Форму и поэтому легко были узнаваемы по морфологическим признакам. Количество микроорганизмов, окрашенных предлагаемым способом, можно определять различными методамиг све.товой и люминесцентной микроскопией, автоматическим счетом на микрофотометре, или микрофлуориметре, а также макрометодами, в.частности Флуоримет рйей.

На фиг. 5 показана калибровочная кривая для .окрашенной примулином суспенэИН кле;ок Е.со11 (17-часовая куль-30 рура, содержащая практически одни живые клетки) до. и, после тепловой инак» тивации с регистрацией флуоресценции. в кювете на спектрофлуориметре. Инактивация дает .возможность измерятв ко-35 личество первоначально живых клеток по приросту флуоресценции после инактивации и определению числа клеток по предварительнУ построенной калиб:ровочной кривой. Люминесценция сус- 4(} пензии ..мертвых клеток не. увеличива лась после .ийактивации.

Использовали .культуру. следующих возрастов: Kscherichia coli - - 7-ча совая, Вас .11ив thuringiensis - 17часовая, Saccharomyces cerevisial24 часовая. ,(итенсивность люминесценции от отдельных клеток s мазках на предметных стеклах измеряли (в условныс единицах О на лкыинесцентном-микроскопе а помощью Фотометрической насадки и выражали в процентах по отношению .к наивысшей величине, полученной в даиной серии опытов.

Величину оптической плотности вычисляют по формуле Е " вЂ, гд Х - интенсивность падаккцего света Х -. ин тенсивность света,. прошедшего через клетку. Хо и I измеряют иа микроскопе ИЛ-2 с помощью фототермической на-бО садки при освещении црепарата мазка снизу красным светом. Величину оптичесной плотности выражают в процентах по отношению к наивысшей величине, полученной в данной серии Опытов

На фиг. 1 показаяа зависимость степени окраски клеток красителями. от температуры при тепловой инактивации: 1) Е .coli + примулин7 2) Вас.

thurincriensis + .примулин; 3} Sacch.

cerevisiae + метиленовый синий;

4) Sacch. cerevisiae + тиазиновый красный.

Время тепловой инактивации " 2 мин. По оси ординат - процент устред-. .ненной интенсивности. люминесценции отдельных клеток в случае флоурохромов-, ,или усредненной величины оптической плотности в случае мегиленового.сине-, гоо °

По оси абсцисс — температура инак-. тивации.

На фиг. 2 — зависимость .степени окраски клеток красителями от време ни тепловой инактивации. 1}. Е,coli+ примулин; 2) Bac. thuringiensis .1- примулин} -3} Sacch, cerevisiae + xe», тиленовый синий; 4) Sacch,: cerevi

siae + тиазиновый красный ° температура .инактивации в случае

Bac; thuringiensis. — 80 С, в оаталь" ных случаях - 98 С.

По оси ординат - то же, что и.на фиг. 1.

По оси абсцисс — время инактивацйи в минутах. . Ha фиг.3. - зависимость степейи ох+ рааки клеток красителями от, концентрат" ции Фенола при инактивацин l)E,cori+, ° ° ° римулин; 2) Вас. И пг5лщ1епвАв + римулин; 3)- Sacch. cerevisiae- + ме тиленовый синий. . По оси ординат — то же, что и иа

Фиг. 1.

По оси абсцисс - концентрация фе-. нола в процентах.

Возраст клеток - как На- фнг. 1.

На фиг. 4 - зависимость- степени окраски клеток красителями от времени инактивации Феиолом: 1) е.coli -+ примулин} 2) Ваа. thuri giensis + нринулину 3) Sacch. сегечЬ.вМе + метиленовый синий. концентрация:фенола в случае дрожжей — 1ОЪ, s остальных случая» - 7В..

По оси ординат - то ке, что и на фиг. 1.

По оси абсцисс --время йнактивации в минутах.

Возраст клеток - как иа Фнг. 1. на фиг. 5 — зависимость Флуоресценции суспензии 17-часовой кудьтуры

Е.со11, окрашенной примулииом, от концентрации клеток, до и йосле ииактивации: 1) суопензйя до инактивации

2) суспензия после инактивации при

98 С в течение 30 с. .По оси ординат - интенсивность лю" минесценции.при )-=490 им (Азоэб.

365.нм}.

По оси абсцисс - общая концентрация клеток.i пробе 10 кл/мл.

Концентрация примулина $0 «асг/ь

Ъ

П .р и м е г 3. К 1,8 мл суспензии клеток 17-часовой культуры Bac. thuringiensis, содержащей жиь ге:и мертвые клетки, добавляют 0,2 мл раствора примуллна (1 мг/мл) на 1/15 M фосфатном буфере рН 6,0-7,8, через 3 мин измеряют число мертвых ярко флуоресцируяцих клеток, как указано в примере 1, затем добавляют к суспензии фенол в виде концентрированного спиртового раствора до кенцентрации 7%, измеряют общее число флуоресцирукщих клеток, как указано в примере 1, и по разнице между двумя отсчетами находят число живых клеток.

Пример 4. К 1 8 мл суспензии

24-часовой культуры Sacer. cerevisiaey содержащей различные соотношения живых и мертвых (убитых нагревом) клеток добавляют 0,2 мл водного раство". ра тиаэинового красного (1 мг/мл), через 3 мин измеряют число мертвых ярко флуоресцирукщих клеток, как указано в примере 1, затем добавляют к измеряют общее число флуоресцирующих клеток, как указано в примере 1, и по разнице между двумя отсчетами находят число живых клеток.

Результаты определения числа живых н мертвых клеток предлагаемым и контрольным способами представлены в таблице.

10189

Объект

Условия обработки

Количество живых клеток, В

Задано в суспензии путем смещения известных коли» честв живых и мертвых клеток

Определено предлагаемым способом

Определено контрольным способомг посевом на питате;;ьную среду

Определено предлагае- мым способом Йicoli

Окраска примулином, ииактивация твплом

Окраска примулииом, инактивация фвиолом

Окраска метилвновым синим ииактивация теплом

100

102

Вас.

thrrin-„

eiesis

Sacch.

cereviа1ае

100

106

1:1,05

2,90г1 0

1:1

3г-1

1г3,08

1г3

Sacch.

cerevi

siae Окраска тиазиновым красным, инактивация этанолом

l. 1

3:1

1! 1,03

2 93г1,0

1г3 03

1г3

Измерения проводились на спвктрб=" флуориметре Aminco Bowman.

Пример 1. К 1,8 мл суспенэии клеток E. coli (8"часовая культура), содержащей живые и мертвые клетки, добавляют 0,2 мл раствора примулина (1 мг/мл) на 1/15 М фосфатном буфере рН 6,0 - 7,8, через 3 мин готовят клеточный препарат по Виноградскому, считают число ярко флуоресцирунщих мертвых клеток, а оставшуюся суспен- 10 зию пригревают 3 мин при 98 С, снова готовят клеточййй препарат по Виноградскому, считают общее количество флоуресцирукщих клеток и по разнице между двумя отсчетами находят число 15 живых клеток. Клетки в препаратах просчитывают на люминесцентном мйкроскопе при возбуждении сверху синефиолетовым светом (объектив r 90, окуляр 10). 20

Пример 2. К 1,8 мл суспензии

24-часовой культуры Sacch. cerevd.sia@, содержащей различные соотношения жи= вых и мертвых (убитых спиртом) клетогг, добавляют 0,2 мл водного раство» 5 ра мвтиг.енового синего (1 мг/мл) и проводят операции, как указано в примвре 1, за исключением того, что подсчет ведут на светопольном микроско,пе при освещении снизу и считают клетки, ярко окрашенные в синий свет.

Соотношение живыегмертф вне.101аюо

fS

Составитель В.Голнмбет

Редактор О.Половка Техреду.Костик КорРектоР Л.Бокван

Заказ 3636/20 Тираж 523 . Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий .

113035, Ж-35 Раушская наб., д. 4/5 юю Мюэ ВМВ Ю

Филиал ППП Патент, г,ужгород, ул.Проектная, 4

Такиьг образом, предлагаемый способ по сравнению с известная позволяет ускорить определение с 26 ч до

1-1,5 ч а также снизить трудоемкость в за счет проведения простых операций, не требующих омывок реактивов н поз воляющнх использовать один набор регистрнруюв ей аппаратуры.