Способ получения биомассы @ @

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОМАССЫ . Е.СОЫ, включсиощий культивирование Es ijierichia Coli В на питательной среде, содержащий источники углерода te азота, минеральные соли и ростовые факторы, инфицирование, прл5гчен-. ,ной биомассы фаг9м Т. am 82 и инкубацию с послёдукхцим в(:Шелднием ферментов нуклинового обмена, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода биомассы в питательную среду допо11нительно вводят -глутативн в концентрации 0,01в ,015 г/л, инфицирование биомассы фагом осуществляют при плотности культуры 3,0-3,3-10 клеток в 1 мм кульi туральной жидкости, а постинфекционную)Щ инкубацию проводят в течение 28- л 130 мин при рН 7,5-7,6.

СОЮЗ СОМТСНИХ

CNNIIHII

РЕСПУБЛИК

Эию С12Ы

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

00 ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3354471/30-15 (22) 10 ° 11 81 (46) 30. 04. 83. Бюл. 9 16 (72) P .Ô. Ренхо4а, 3.A. Шомштейн, Л.X.Èêêåëücoíå, A.Â.Äàèëåðñ и И.A.ПЬи те (53) 576.806(088.8) (56) 1. иа1)сег G.C и др, T -,induced oligoribonucleotides . Р ос °

Nat. Асай, Sci. USA. v .72, 1975, р. 122-126.

2. Richardson Ch. С. Polynucleotidekinase from E. coli infected, и1ФЬ bacteriophage Т, ", — Proc in

h1ucl Acids, Res. V 2, 1971, р, 815".

828.

ÄÄsuÄÄ1014883 А (54) (57) спОсОБ полУчения s)(omccg-

Е.COLI, включакщий культивирование

Es herichia Cali В на питательной среде, содержеац и источники углерода

В азота, минеральные соли и ростовые факторы, инфицирование получен,ной биомассы фагом . T am 82 и инкубацию с последуюцим вКПелением ферментов нуклинового обмена, о т— л и ч а ю шийся тем, что, с целью повывмния выхода биомассыо в питательную среду дополнительно вводят

-глутатиен в концентрации 0,018,015 г/л, инфицирсвание биомассы фагом осуществляют при плотности культуры 3,0-3,3.10 клеток в 1 мм куль; туральной жидкости,апостинфекционную@ инкубацию проводят в течение 28130 мин при рН 7,5-7,6. 1 014881

Изобретение относится к способам получения -биомасс, обогащенных биоло" гически активными веществами.

Известен способ получения биомассы микроорганизмов с PHK-лигазной активностью, где в качестве продуцента используют Е.Coli В, а в качестве ин" ,дуктора PHK-лигазы фаг. Т 4+-, Выход биомассы не указан, Активность РНКлигазы 3,7 ед. на мг белка (1) .

Наиболее близким к предлагаемому является способ заключающийся в том, что биомассу с полинуклеотидкиназной активностью получают культивированием бактерии E.Coli В на питательной среде, содержащей r/л; аммоний хлорис 15 тый 1; магний сернокислый 0,13 калий фосфорнокислый однозамещенный 3,0; натрий фосфорнокислый двуэамещенный

6,0; глюкоза 4,0; казаминовые кисло,ты 2, О. 20

Температура выращивания 37 С. Усо ловия индукции ферментов фагом: плотность культуры Е.Coli 2 10 клеток/мл множественность инфекции 4 фаговых частицы на клетку. В качестве биости-75 мулятора добавляют триптофан 0,01 г/л, Накопление фермента проводят в течение 12 мин после инфекции фагом.

Выход биомассы 2,5 г/л. Активность полинуклеотидкинаэы 40 ед/мг бел- 30 ка (2) .

Однако при этом сравнительно низкий выход биомассы, так как на стади. ях инфицирования культуры и постинфекционной инкубации не обеспечены условия для интенсивного протекания процесса.

Цель изобретения - повышение выхода биомассы, Поставленная цель достигается тем, что в способе получения биомассы 40

Е.Coli В на питательной среде, содержащей источники углерода и азота, минеральные соли и ростовые факторы, в питательную среду дополнительно вводят глутатион в концентрации 0,01-45

0,015 г/л, инфицирование биомассы фагом ТатпР 82 осуществляют при плотности культуры 3,0-3,3.10 клеток/мл

9 культуральной жидкости, а постинфекционную инкубацию проводят в течение 50

Ъ

28-30 мин при рН 7,5-7,6, Пример 1. Культуру Е.Со11 В выращивают на питательной среде следующего состава, г/л:

NH C i 1,0+1,2 55

ИдйО47Н О 0,13+0,15

КН2РО4 . 3,0+3,5

На2НРО4

9 0+10 0

Глюкоза 10,0+15,0

Гидролизат 60 казеина 8,0-1,0,0

Дрожжевой экстракт 1,0-1,2 рН 7,2-7>4

Глюкозу вводят в питательную среду в виде стерильного раствора. Пролипазы 5,5,2 ед/мк белка.

Пример 2. Питательная среда содержит, г/л:

NHgC1 1,2

ЩЯОд 7Н20 0,13

КН2 РО 3,,0

Na HPO+ 9,0

Глюкоза 15,0

Гидролизат казеина

Дроя<жев ой э к с трак т рН

10,0

1,2

7,2-7,4

Глюкозу вводят в питательную среду в виде стерильного раствора.

Выращивание Е,Coli В.

1) Инокуляция посевного материала, Культура E ° Coli В поддерживается на столбиках МПА вазелиновым маслом, пересевается один раз в 4 месяца. Для подмолаживания культуру засевают в

100 мл основной среды с содержанием глюкозы 0,5 г/л, инкубируют 10-12 ч о при 37+ 1 С стационарно. Инокулят готовят, пересевая 10-12 часовую культуру на 1 л свежей среды с содержанием глюкозы 1, О г/л из расчета 1: 8 и выращивают в течение 4-5 ч в условиях аэрации.

2) Ферментация культуры Е.Coli В производится после добавления 4нокулята 1:20 по отношению к объему среды. Ферментация производится при

37+10C в условиях принудительной аэрации (2 л воздуха на 1 л питательной среды).

3) Инфицирование E.Coli В фагом

Т+сце82. Когда плотность культуры достигает 3,3 10 клеток/мл (по калйброК вочной кривой), прекращают аэрирование, добавляют суспензия бактериофага из расчета 2 фаговые частицы на

1 клетку бактерии, т.е, 6,6 ° 10 БОЕ на 1 мл культуральной жидкости. Одновременно добавляют глутатион

0,015 г/л.

4) Постинфекционное инкубирование проводят при рН 7,5-7,6, регулируемое раствором НН ОН и аэрации 2л воз духа на 1 л питательной среды в теводят культивирование в условиях принудительной аэрации до тех пор, пока плотность культуры достигнет

3,0-3,3-109 клеток/мл культуральной жидкости, и осуществляют инфицирование фагом из расчета 2 фаговые частицы на 1 клетку бактерии, одновременно добавляют глутатион в концентрации 0,010-0,015 г/л и продолжают культивирование 28-30 мин, поддерживая рН 7,5-7,6. Процесс прекращают охлаждением культуральной жидкости др 5ОС °

Выход биомассы 7,0-8,5 г/л

Активность полинуклеотидкинаэы 45-47 ед/мг бел " ка

Активность PHK 3.014881

0,15

3 5

10,0

10,0

8,0

Составитель Р,Куриленко

Редактор Е.Лушникова Техред В.Далекорей Корректор Ю.Макаренко

Заказ, 3132/21 Тираж 523 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж»35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент, г.ужгород, ул.Проектная, 4 чение 28 мин, после чего быстро охлаждают культуральную жидкость до

5оС

Выход биомассы 8,5 г/л, Активность полинуклеотидкиназы 47 ед/мг белка, 5 . Активность PHKлипазы 5,0 ед/мг белка.

Пример 3. Питательная среда содержит, г/лг

НН4С 1

МПВО, 7Н2О 4 яа НРО4

Глюкоза

Гидролизат казеина

Дрожжев ой экстракт 1,0 рН 7, 2-7,4

Введение глюкозы, инокуляция посев-Я ного материала, ферментация культуры подобны. примеру 1.

Инфицирование Е.Coll В фагом Т М2 проводят, когда плотность культуры достигает 3.10 клеток в мл,добавляют сус 5 пензию бактериофага иэ расчета 2 фаговые частицы на 1 клетку бактерии, т.е. 6. 109БОЕ на 1 мл культуральной жидкости, глутатион добавляют в количестве 0,01 г/л. Постинфекционную ин- 3О кубацию проводят 30 мин. Выход биомассы 0,7 г/л.. Активность полинуклеогидкиназы 45 ед/мг белка. Активность

PHK липаэы 5,2 ед/мг белка.

Пример 4 ° Питательная среда, введение глюкозы, инокуляция посевного материала, ферментация культуры

E.Coll В подобны примеру 1.

Инфицирование E ° Coll В фагом Т cltn

82 проводят-, когда плотность культуры достигает 3,2-109 клеток в 1 мл культуральной жидкости, добавляют суспензию бактериофага из расчета 2 фаговые частицы на.1 клетку бактерии, т,е. 6,4-105ОЕ на 1 мл культуральной жидкости, глутатион добавляют в 45 количестве 0,013 г/л. Постинфекционную инкубацию проводят.в течение

29 миМ.

Выход биомассы 8,0 г/л. Активность полинуклеотидкиназы 46 ед/мг белка; 50

Активность PHK-лигазы 5,1 ед/мл белка.

Применение предлагаемого способа обеспечивает хороший выход биомассы (7,0-8,0 r/ë) с активностью полинуклеотидкинаэы 45-47 ед/мг белка и PHKлипазы 5-5,2 ед/мг белка.

Выращивание культуры до плотности клеток 3 — 3,3 х 10 в, 1 мл культуральной жидкости,множественность инфицирования 2 фаговых частиц на бактериальную клетку достаточна для того, чтобы каждая микробная клетка была атакована фаговой частицей, при этом не чызывая лизирования клеток извне, что может иметь место при более высокой множественности инфицирования. Добавление глутатиона в питательную среду способствует прикреплению фаговых частиц к поверхности клеток Е.Coll u активизирует мембранные процессы. Таким образом достигается 98-100% инфицирование клеток фагом, что интенсифицирует накопление ферментов, так как фаг является индуктором и полинуклеотидкиназы и PHK-липазы.

Осуществление постинфекционной инкубации в течение 28-30 мин способствует накоплению PHK- . липазы в то же время без снижения активности полинуклеотидкиназы, максимум активности которой наблюдается к 23-25-ой минуте постинфекционной инкубации, Образованию и стабилизации целевых ферментов и биомассы способствует ведение постинфекционной инкуба-- ции при рН 7,5-7,6, .Технико-экономический эффект предлагаемого способа заключается в обвспечении получения ферментов PHK-липазы и полинуклеотидкиназы комплексным путем.

Способ обеспечивает повышение выхода биомассы и целенаправленное на-. копление в ней ферментного комплекса полинуклеотидкиназы и PHK-линзы в

3-.3,5 раза.