Способ определения степени тяжести гипоксии мозговой ткани

 

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТЕПЕНИ ТЯЖЕСТИ ГИПОКСИИ МОЗГОВОЙ ТКАНИ путем создания гипоксическбго состояния у экспериментального животного. умершрления мгновенным замораживанием животного с последукхцим извлечением мозговой ткани и определением в ней аденозинтрифосфорной кислоты и фосфокреатина, отличающийс я тем, что, с целью дифференцирования степеней тяжести гипрк;сии, в мозговой ткани дополнительно определяют содержание гуанозинтрифосфорной кислоты и при снижении содержания гуанозинтрифосфорной кислоты на 30-50% относительно нормы и при нормальном содержании аденозинтрифосфорной кислоты и фосфокреаткна определяют легкую степень гипоксии, при снижении гуанозинтрифосфорной кислоты на 51-70% и адеi нозинтрифосфорной кислоты на 20-40% при нормальном содержании фосфокреа (Л С тина определяют среднюю степень.гипоксии , а при снижении гуанозинтрифософрной кислоты на 71-90%, аденозинтрифосфорной кислоты на 50-70%, а фосфокреатина на 40-60% определяют g тяжелую степень гипоксии мозга; v rsD О J

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

„.SU„„

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

AO ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 2986388/28-13 (22) 08. 07. 80 (46) 30.05.83. Бюл. Р 20 (72) Е.M.Õâàòoâà, A.Н.Сидоркина, Г.В.Миронова и И.H.Балишина (71) Горьковский медицинский институт им. С.М.Кирова (53) 611-018.834(088,8) (56) 1. Саратиков A.Ñ., Волошина Э.И.

Энергетический обмен мозга при острой гипоксической гипоксии.- Известия

CO AH СССР, сер. бнол. наук. 1971, 5,1, 119-126 (аналог).

2 ° Eowiy О.Н. Passonneau I.V., Hasseberger J,Х. and Sohult D.W. Effect of Schemid on Known substrates and cofactors of glycolytis pethway in brain J.Bid Chemistry 1964, 239, р. 18-30. (54)(57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТЕПЕНИ тяжЕСтИ ГИПОКСИИ МОЗГОВОЙ ткЛНИ путем создания гипоксического состояния у экспериментального животного, умерщвления мгновенным эамораживани= ем животного с последующим извлечением мозговой ткани и определением в ней аденозинтрифосфорной кислоты и фосфокреатина, о т л и ч а ю щ и й— с. я тем, что, с целью дифференцироваHHH степеней тяжести гипоксии, в мозговой ткани дополнительно определяют содержание гуанозинтрифосфорной кислоты и при снижении содержания гуано-" эинтрифосфорной кислоты на 30-50% относительно нормы и при нормальном содержании аденоэинтрифосфорной кислоты и фосфокреатина определяют легкую степень гипоксии, при снижении гуанозинтрифосфорной кислоты на 51-70% и аденозинтрифосфорной кислоты на 20-403 ф при нормальном содержании фосфокреатина определяют среднюю степень гипоксии, а при снижении гуанозинтрифософрной кислоты на 71-903, адено- С зинтрифосфорной кислоты на 50-70%, а фосфокреатина на 40-60% определяют Я тяжелую степень гипоксии мозга;

Ье4

1 02077.7

Изобретение относится к медицине, а именно биохимическим способам оценки тяжести гипоксии ткани.

Известен способ определения .степени тяжести гипоксии мозговой ткани, включающий исследование содержания 5 макроэргических фосфатов (1).

Однако степень изменения этих соединений может быть невелика даже при острых и глубоких нарушениях снабжения кислородом чувствительных к гипок-10 сии органов и тканей.

Наиболее близким к предлагаемому является способ определения тяжести гипоксии мозговой ткани путем создания гипоксического состояния у экспе- 5 риментальных животных, умерщвления ,мгновенным замораживанием животного с последующим извлечением маэгс»вой ткани и определением в ней аденоэинтрифосфорной кислоты и фосфокреатина (2) .

Однако. известный способ не позволяет дифференцировать легкую, среднюю и тяжелую формы гипоксии, а также вйявить гипоксическое .повреждение ткани на самых ранних стадиях.

Цель изобретения - дифференцирование степеней тяжести гипоксии.

Поставленная цель достигается тем, что в способе определения степени гипоксии мозговой ткани. путем создания гипоксического состояния у экспериментального животного, умерщвления мгновенным замораживанием животного с последующим извлечением мозговой ткани и определением в ней аденозин- 35 трифосфорной кислоты и фосфокреатина, отличительной особенностью является то, что в мозговой ткани дополнительно определяют содержание гуанозинтрифосфорной кислоты и при снижении со- 40. держания гуаноэинтрифосфорной кислоты на 30-50% относительно нормы и при нормальном содержании аденозинтрифосфорной кислоты и фосфокреатина определяют легкую степень гипоксии, 45 при снижении гуаноэинтрифосфорной кислоты на 51"70% и аденозинтрифос.форной кислоты на 20-40% при нормаль" ном содержании фосфокреатина определяют среднюю степень гипоксии, а при снижении гуанозинтрнфосфорной кислоты На 71-90Ъ, аденоэинтрифосфорной кислоты на 50-.70%, а фосфокреатина . на 40-60% определяют тяжелую степень . гипоксии мозга.

Способ осуществляют б ищующим об- 55 разом.

Исследуемую ткань помещают в жид-. кий азот, замораживают, затем растирают в тонкий порошок в ступке с жидким азотом. Навески ткани берут в 00 предварительно тарированные бюксы, содержащие слегка замороженный 10%-й раствор трихлоруксусной кислоты на

0,5 м ЭДТА из расчета 10 мл/r ткани.

Пробы экстрагируют в течение 20 мин 65 и фильтруют через бумажные фильтры.

ТХУ удаляют трехкратным встряхиванием (по 2 мин) с двумя объемами серного эфира, насыщенного водой. Следы эфира удаляют аэрацией, экстракт нейтралируют до 7,0-.7,4 0,1 NNaOH.

ФКр определяют по Эннору и Розенбергу. Для этого пробу помещают в мягкие условия гндролиза (9 мин в

0,4 NHC1 прн t 6+ . Затем раствор нейтрализуют добавлением 0,4 NNaOH и быстро охлаждают до комнатной температуры. Затем добавляют 0,5 мл

0,004 М раствора пара-хлормеркурий бензоата (ПХМБ), 1 мл 1%-го раствора

-нафтола и 0,5 мл 0,05%-го раствора диацетила. Объем доводят до 5 мл водой ° Содержимое перемешивают, ставят на 30 мин в темноту. Затем измеряют оптическую плотность раствора на ФЭКе при длине волны 540 нм. Нуклеотиды разделяют методом колоночной хроматографии на эктеола-целлюлозе,в Cl-форме. Количество их определяют по поглощению в ультрафиолете на спектрофотометре СФ-16. Нужную фракцию целлюлозы ()50 меш) взвешивают в десятикратном объеме воды, дегазируют и в форме суспенэии.вносят в колонку размером 7 ° 70 мм. Сорбцию нуклеотидов проводят со скоростью вытекания раствора 0,07-0,08 мл/мин. Колонку промы- вают 2-мя мл воды, а затем нуклеотиды элюируют ступенчато растворами HCl возрастакщей концентрации (от 0,011

N до 0,1 N) co скоростью 0,120,16 мл/мин. Сбор фракций проводят капельным методом. Объем каждой фракции доводят до 3 мл, а конечную концентрацию НС1 — до 0 1 N. Онтическую плотность измеряют на С4-16 с толщиной слоя 1 см при длинах волн 260290 нм для АТФ и 260-310 нм для ГТФ.

Расчет концентраций нуклеотидов проводят по коэффициентам молярной экстинции: 14300.- для АТФ, 12200 - для

ГТФ. Возврат суммарной экстинции с колонки составляет 98-100%.

После определения ссдержания ГТФ, ATC н Фрк в мкй/r ткани полученные данйые сравнивают с нормой. При атом нормальное для данной ткани содержание ГТФ, АТФ и Фрк принимают за 100@.

Содержание ГТФ, АТФ и Фкр в исследуемой на гипоксию ткани выражают в Ъ к норме. Рассчитывают разницу между содержанием ГТФ, АТФ, Фкр и при гипоксии (в %) и при снижении ГТФ на

40-443 относительно норьы и стабильности АТФ и Фкр диагностируют легкую степень гипоксииупри снижении ГТФ на

45-503,АТФ íà 10-30% и стабильности

Фкр диагностируют среднюю степень тяжести гиноксииупри снижении ГТФ на

603 и более,ATC на 50% и более,Фкр на.

50% и более - тяжелую форму гипоксии.

Примеры конкретного исполнения способа.. 1020777

4(}

Содержание исследуемых компонентов (мкИ/г ткани мозга) Гипоксия

ФКР

Норма: кролики

0,24+0,03

2,76+0,06

2g08i0,07

1,63+0,08

2, 53+ 0,14

0,33+0,02

3,03+0,18 крысы

Гипоксическая (кролики) 0,24+0,03

2 4910,16

Циркуляторная (крысы) 2,08+0,07

0,14+Oi03

3,2310,21

Пример 1. Для определения степени тяжести гипоксического повреждения ткани мозга у кролика, выдержанного в течении 30 мин в барокамере на высоте 7000 м, в ткани мозга определяют содержание ГТФ, АТФ, ФКр. В нор-. 5 ме содержание этих компонентов в мозге кроликов, следующее: ГТФ вЂ” 0,24+

10,03 мкМ/г ткани) АТФ - 1,76+

i0,06 мкИ/г ткани) ФКр — 2,53+

+0,l4 мкМ/г ткани. 10

В исследуемой ткани содержание оп" ределяемых компонентов таково: ГТФ—

0,16 мкМ/г ткани; АТФ 1,72 мкМ/г ткани; ФКр- 2,80 мкМ/г ткани.

Следовательнb, имеется снижение 15 содержания ГТФ на 33% относительно

)яормы, АТФ и ФКр стабильны. Эти изменения соответствуют легкой степени гипоксического повреждения. Ранее известные способы не позволяли выя- 2О вить начавшиеся изменения энергетического обмена.

Пример 2; В исследуемой ткани выявлены значительные нарушения энергетического обмена, свидетельствующие о возникновении гипоксии. С целью оценки тяжести гипоксического. повреждения ткани мозга проведено определение содержания в ней ГТФ, АТФ и ФКр по предлагаемому способу. Получены следующие результатыг АТФ—

1,40 мкИ/г ткани, против 3,03 +

0,18 мкИ/г ткани в HGpMG) ГТФ0,14 мкИ/г ткани против 0,33+0,002 в норме; ФКр — 3,05 мкМ/г ткани против 3,0310,18 в норме.

Таким образом, выявлено- снижение

2"х компонентов: АТФ на 33%, ГТФ— на 58%, что соответствует средней степени тяжести гипоксии.

Пример 3. В исследуемой ткани содержание ГТФ, АТФ, ФКр следующее: .ГТФ - 0,09 мкМ/г против

0,33 мкМ/г 0,02 в норме) АТФ вЂ .. 45

0,79 мкИ/г против 2,08 мкМ/г+0,07 в норме; Фкр — 1,47 мкМ/г против 3,03

0,18 в норме.

То есть, содержание ATC снижено на 62%, ГТФ - на 73%, Фкр — на 52%, что соответствует тяжелой форме гипоксии. Анализ проведен вслепую. Была взята ткань мозга крысы, подвергшейся действию циркулятора гипоксии в течение 18 ч (35% животных после такой экспозиции гибнут, что является одним иэ подтверждений крайне тяжелых и необратимых нарушений энергетического обмена)..

Исследованиями ткани мозга 50-ти экспериментальных животных, подвергшихся действию гипоксии различного вида и длительности и контрольной группы (46 опытов) установлено наличие глубоких коррелятивных связей между .изменениями комплекса АТФ, ГТФ, Фкр и,тяжестью гипоксического повреждения ткани.

Гипоксическая гипоксия в барокамере на высоте 7000 м в течение 30 мин (принятая модель легкой степени тяжести гипоксии) характеризуется следующими изменениями комплекса АТФ, ГТФ, Фкр в ткани мозга кроликов Фкрстабилен, 2,83 мкМ/г ткани мозга

+ 0,21 против 2,53+0,14 в норме (112% против 100% — различие недостоверно); АТФ вЂ” не изменяется, 1,71

0,06 против 1,-76+0,06 мкМ/г ткани в норме (97% против 100% — различие недостоверно)) ГТФ вЂ” снижается на 43,4%, 0,16 мкМ/г ткани мозга 0,03 против

0,24 - 0,03 в норме.

Пребывание в барокамере на высоте 8000 м в течение 30, а также перевязка общих сонных артерий на 30 мин (модели гипоксии средней тяжести) вызывали снижение ГТФ на 45%, АТФ на

10-30%, ФКр — оставался стабильным.

В таблице показано содержание АТФ, ГТФ, ФКр в мозге экспериментальных животных (кролики, крысы) в норме и при гипоксической и циркуляторной гипоксии средней тяжести °

1Ого777

Составитель С.Малютина

Редактор О.Сопко . ТехредЖ.Кастелевич. Корректор А. Ильин

Заказ 3892/39 Тираж 873 Подписное

ВЫКИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий.

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент, r.Óæãîðîä, ул.Проектная, 4

При циркуляторной гипоксии экспозицией 18 ч(модель тяжелой формы гийоксии мозга) нарушалась стабильность всех трех компднентовгГТФ - снижалась на. 73% и более(до 0,09 мкМ/г ткани

+0 04 - 0,33 мкМ/г ткани + 0,02 в йорме) АТФ вЂ” на 62% (до. 0 79 мкМ/г ткани и 0,06 с, 2,08 мкМ/г ткани +0,07 в норме)у ФКр - на 50% и более (с

3,03+0,18 мкМ/г ткани в норме до

1,47 0,16 мкМ/г ткани).

Определение содержания ЬТФ, ГТФ, ФКр в ткани мозга экспериментальнык животных проведено в ll опытах на модели легкой формы гипоксии,.в 16 опы» тах на моделях средней формы гипок- 15 сии (8 - гипоксическая гипоксия H 8 циркуляторйая гийоксия)и в 23 опытах с тяжелой формой гипоксии.

Предлагаемый способ позволяет дифференцировать легкую, среднюю и тяжелую гипоксии ткани, например мозга, а также по снижению содержания в ткани ГТФ позволяет диагностировать гипоксию на более ранней стадии чем из-. вестные способы, используюцие в качестве раннего критерия гипоксии снижение АТФ.

Способ позволяет оценить состояние энергетического обмена ткани и тяжесть гипоксических нарушений путем исследования всего трех показателей энергетического обмена.