Способ получения ферментного препарата глюкоизомеразы

Авторы патента:

1, СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА ГЛОКОЗОИЗОМЕРАЗЫ, предусматривающий обработку биомассы продуцента лизоцимом, отделение бесклеточного экстракта и выделение из него .фермента осаждением, отличающийся тем, что, с целью упрощения процесса, а также повышения активности и стабильности преп%рата , в качестве продуцента используют Streptofflyces о1Ivochromogenes АТСС ff 21713, АТСС Jf 21715, биомассу продуцента предварительно обрабатывают водным раствором 2-пропанола при концентрации последнего в смеси 1-43 мас., лизоцим используют в количестве 6,8 ед/мг сухого веса клеток , а осаждение фермента осуществляют сульфатом (нагния, взятым в количестве 0,02-0,3 Н на общий объем смеси. 2. Способ по П.1, о т л и ч а ющ и И ся тем, что концентрацию 2-пропанола на всех стадиях процесса поддерживают постоянной и равной мас..

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

0% (И) ps C 12 N 9/92

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН

И ЙАТИНТУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 2461108/28 13 (22} 18.03,77 (31) 668380 (32) 19.03 76 (33) США (46} 15.06.83. Бюл. и 22 (72} Роберт Пол Кори (США) (71) СПС Интернэшнл Инк (США) (53) 577 15 ° 07 (088. 8) (56) 1. Патент GIN II 3779869» кл. 195-68, опублик. 1973.

2. Патент США и 3821086, кл. 195-116, опублик 1974.

3. Патент США If 3788945,. кл. 195-.31, опублик. 1,974.

4. Danno J. Yochimura S„,Natake Н.

"Stud ås on 0-Olucose-isomerlqing

Activity of 0-Xylose-grown Cells

from Bac1I)us coagulans, Strain

Нй-68-. "Agr. В1о1. Сhem " 1967, чо1. 31, М 3,284-292.

5. Патент США И 3813318, кл. 195-31 опублик. 1974. (54)(57) 1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА ГЛЮКОЗОИЗОМЕРАЗЦ, предусматривающий обработку биомассы продуцента лизоцимом, отделение бесклеточного экстракта и выделение из него фермента осаждением, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью упрощения процесса, а также повыше" ния активности и стабильности преп рата, в качестве продуцента используют Streptomyces olivochromogenes

АТСС II 21713, АТСС 11 21715, биомассу продуцента ) предварительно обрабатывают водным раствором 2-пропанола при концентрации последнего в смеси

41"43 мас.3, лизоцим используют в количестве 6,8 ед/мг сухого веса клеток„ а осаждение фермента осуществляют сульфатом магния, взятым в количестве 0,02-0,3 M на общий объем смеси.

2. Способ по и. l, о т л и ч а юшийся тем, что концентрацию

2-пропанола на всех стадиях процесса поддерживают nocTORHHOA и равной 11-43 мас.3.

1024014

Изобретение относится к ферментной промышленности и касается получения препарата глюкозоиэомеразы, используемого для переработки глюкозосодержащего сырья во фруктозосодержащие продукты.

Переработка глюкозы во фруктозу (изомеризация) обеспечивает получение продукта, который практически

1О представляет собой заменитель торгового сахара. В данном случае исходным продуктом является глюкоза, моносахаридный сахар (примерно 703 сладости сахарозы), который наполовийу перерабатывается в сахар,с, 15 примерно 1403 сладости сахарозы или инвертного сахара. Высокая сладость представляет интерес для получения кукурузной патоки, содержащей фруктозу. 20

При изготовлении кукурузной патоки с высоким содержанием фруктозы энзиматическая изомеризация глюкозы предпочтительно должна производиться на непрерывной основе для того, что- 25 бы экономично получать коммерчески пригодную кукурузную патоку с высоким содержанием фруктозы. Обычно глюкозный сироп контактирует с большим количеством препарата изомеразы, который размещается на инертном веществе, например на препарате иммо" билизованного энзима изомеразы глюкозы.. Особенностью такого способа является использование препарата им" мобилизованного энзима изомераэы глюкозы, который обладает высокой концентрацией изомеразной активности на единицу объема, делая энзим пригодным для процесса непрерывной энзиматической изомеризации.

Глюкозоимеразу обычно получают внутриклеточным путем, т.е. большая часть энзима изомеразы глюкозы размещается. в- пРеделах и/или на оболоч- 45 ках клетки микроорганизмов, из которых его получают. В некоторых процессах непрерывной изомеризации предполагается использование целых клеток содержащих изомеразу глюУ

50 козы. Такие процессы обычно требуют специальной обработки клеток для предупреждения экстракции изомеразы глюкозы из клеток, так что энзим фактически иммобилизуется в самих клетках, и/или специального. оборудования для решения гидравлических проблем при прохождении содержащего глюкозу раствора через слой клеток, содержащих энзим изомеразы глюкозы (1 ) и (23.

Недостатки способов в которых

1 используются целые клетки, содержащие изомеразу, включают гидравлические проблемы, образование загрязняющих примесей из-за неиаомеразных энзимов, нуклеиновай кислоты и других материалов в оболочках клеток и более длительного времени контакта глюкозного .раствора с препаратом клеточного энзима в щелочных условиях вызывает образование нежелательных продуктов, таких как псикоза и гидроксиметилфурфурол. Это приводит к повышению стоимости производства из-за необходимости рафинирования для удаления образующихся загрязняющих примесей и/или получению низкокачественного продукта.

Известны способы, при которых изомеразу глюкозы выделяют из клеток, получают ее в растворимой форме, затем иммобилизуют на водорастворимом инертном носителе. Иммобилизованный энзим становится пригодным для использования в непрерывной переработке глюкозы в кукурузную патоку, содержащую большое количестso фруктозы.

Например, известен способ, в кото. ром внутриклеточная изомераза глюкозы, полученная из Streptornyces sp.

АТСС 21175, выращенного на ксилозе и гидрозате ксилана, обрабатывается катионным детергентом, с последующей обработкой диэтиламиноэтилцеллюлозой для удаления примесей. Содержащий изомеразу глюкозы фильтрат затем иммобилизуют на ДЭАЭ целлюлозе или синтетической анионообменной смоле для получения биокатализатора для непрерывной изомеризации глюкозы во фруктозу j3).

Однако способы, основанные на иммобилизации фермента, предусматривают использование выделенной из клеток растворимом глюкозоизомеразы.

Способы придания растворимости изомеразе глюкозы известны. Однако необходимо получить не содержащую клеток и растворимую изомеразу глюкозы высокой степени чистоты, которая будет обладать высоким уровнем изомеразной активности на единицу объема.

Использование высокоочищенного и концентрированного энзима повышает эффективность, с которой энзим мо1024014 жет быть иммобилизован на нерастворимом носителе.

Известен способ получения ферментйого препарата глюкозоизомеразы путем обработки клеток BaciIIus соа- 5

guIans Нй-б8 этилендиаминтетрауксусной кислотой, затем лизоцимом в количестве л 0,01 мг/мг сухого веса клеток с последующим отделением полученного бесклеточного экстракта и обработкой его О,Т И сульфата марганца для получения преципитата нежелательных материалов. Супермагант несколько раз обрабатывают сульфатом аммония при степени насыщения 15

0,4-0,45 для.осаждения белковой фраквЂ” ции изомеразы глюкозы, которую затем очищают диализом и хроматографией на диэтиламиноэтил-Сефадексе

А-50. Процесс ведут при охлаждении 20 (5 C) 34).

Недостатком способа является его ложность, многостадийность, IlpH этом получаемый продукт не обладает достаточно высокой стабильностью и 25 выходом по активности (503).

Таким образом, остается необходимость в экономичном способе, пригодном для крупномасштабных операций, для получения растворимого и очищенного препарата изомеразы глю-. козы с высоким уровнем активности на единицу объема и высоким уровнем стабильности, пригодного для связывания с водонерастворимыми носителями для использования в непрерывных процессах в производстве кукурузных паток с. высоким содержанием фруктозы, но также пригодного для других процессов изомеризации.

Цель изобретения - упрощение процесса, а также повышение актив. ности и стабильности препарата.

Укаэанная цель достигается тем, что согласно способу получения ферментного препарата глюкозоизомераэы, предусматривающему обработку биомассы продуцентаг лизоцимом, отделение бесклеточного экстракта и

S0 выделение из него фермента осаждением, в качестве продуцента используют Streptomyces о1ivochromogenes ATCC И 21.7I3, ATCC М 21715, биомассу продуцента предварительно обрабатывают водным раствором 2-пропанола при,концентрации последнего в смеси 44-453 мас.4, лизоцим используют в количестве 6,8 ед/мг сухого веса клеток, а осаждение фермента осуществляют сульфатом магния, взятым в количестве 0,02-0,3 И на общий объем смеси.

При этом обычно концентрацию 2пропанола на всех стадиях процесса поддерживает постоянной и равной

41-43 мас.Ф.

Способ проще известного, включает меньше стадий, может осуществляться при комнатной температуре, позволяет достичь высокого уровня активности (934) при высокой стабильности препарата.

Получают водорастворимый стабилизированный концентрат энзима глюкозо изомеразы, состоящий из (1) энзима изомеразы глюкозы, не содержащей клеток, который не содержит нуклеино вой кислоты, и 2 ), водорастворимой соли магния, причем характеризуется следующими константами: содержание протеина 50-803 по весу на сухое вещество; содержанием Иц++ <

3-45 мг Иц++ на миллилитр концентрата энзима; соотношение Иц+ qpoтеин 0,02-0,75; удельная изомеразная активность, по крайней мере

10 ИЕИГ/мг протеина; стабильность, заключающаяся в том, что он сохраняет до 953 своей первоначальной изомеразной активности при хранении при комнатной температуре(26 С) до 30 дней и до 80 + 103 своей первоначальной изомеразной активности при хранении при 180 С до 12 мес.

Концентрат энзима предпочтитель- но содержит смешивающийся с водой органический растворитель, в частности, 2-пропанол, и обладает изомеразной активностью, 5006-8000 МЕИГ/г на сухое вещество. Способ осуществляется контактированием водной смеси, содержащей энзим изомеразы глюкозы, не содержащей клеток, и смешивающегося с водой органического растворителя с небольшим, но эффективным количеством водорастворимой соли магния (сульфата магния ) для эффективного осаждения энэима изомеразы глюкозы. Эта обработка солью магния вызывает образование преципитата энзима изомеразы глюкозы-магния, который извлекается обычными способами, например центрифугированием. Извлеченный стабилизированный концентрат энзима (который .имеет вид толстого слоя шлама) предпочтительно разбавляют небольшим количеством воды для

1024014

5 облегчения его сорбции на. водонерастворимых носителях с образованием высокостабильного, иммобилизованного биокатализатора с высоким уровнем иэомеразной активности на единицу объема носителя. Концентрирование, очистка и стабилизация дают более чем 7о-кратное увеличение концентрации энзима сравнительно с его первоначальной бродильной разводкой, и предпочтительно более чеи 100-кратное увеличение концентрации..Концентрат энзииа также в 10-15 раз чище, чем первоначальныи энзии.

Способ, в частности, включает: обработку водной смеси, состоящей из изомеразы глюкозы, не содержащей . клеток, и смешивающегося с водой ор" ганического растворителя, по существу.водорастворииой солью магния, в количестве достаточном для обеспечения смеси с концентрацией пример.но 0,02-0,3 моль относительно соли иагния, считая на общий объем смеси, для обеспечения получения стабилизированного концентрата энзима, содержащего преципитат энзима магния в сиеси: извлечение стабилизированного концентрата энзима, содержащего энзим изомерааы глюкозы, который содержит магний примерно 0,1-2 моль, B расчете íà Ио, воду и водорастворимый органический растворитель.

Стабилизированный концентрат энзима получают первой обработкой кле" ток, содержащих внутриклеточную изоиеразу глюкозы, водорастворимым органическим растворителем и литическим препаратом энэима - лизоцимом B течение времени, достаточного для дигерирования клеточного материала и для того, чтобы энзии изомеразы глюкозы выделился из клеток в раствор.

Остатки клеток и нуклеиновые кислоты затем удаляют, например, центрифугированиеи, и остается раствор, содержащий энзим изомеразы глюкозь не содержащей клеток, смешивающийся с водой органический растворитель и воду.

Смешивающийся с водой органический растворитель, используемый при осуществлении данного способа, представляет собой предпочтительно органическую жидкость, или ее смеси имеющую водорастворимость по крайней мере 303 и предпочтительно по крайней мере примерно 403 в воде при комнатной температуре. Смешивающийся с водой органический растворитель должен быть растворителем, который уменьшает растворимость протеинов и нулеиновых кислот в водных растворах. Типичные водорастворииые органические растворители, пригодные для осуществления данного способа, включают метанол, этанол, пропанол, 2-пропанол; трет-бутиловый спирт, ацетон, метилацетат и парадиоксан. Предпочтительным смешивающимся с водой органическим растворителем является 2-пропанол

Обычно используют такое количество смешивающегося с водой арганическаго растворителя, которое достаточно для обеспечения водной смеси по крайней мере 30 Bee. i и предпочтительно по крайней мере примерно 40ж по весу относительно смешивающегося с водой органического растворителя.

Однако количество используемого смешивающегося с водой органического растворителя должно быть таким, чтобы значительная часть неизомеразных протеиновых материалов и нуклеиновых кислот осаждались из раствора до добавления соли. Когда в качестве смешивающегося с водой органического растворителя используется 2-пропанол, то водный раствор изомеразы глюкозы, не содержащей клеток, должен содержать 42+1 вес. 1 2-пропанола.

Смешивающийся с водой органический растворитель действует как пре.дохраняющее средство для энзима во время обработки (и во время хранения, если растворитель не полностью удален ) и уменьшает,растворимость энзииа во время добавления соли. Он также действует как осадитель нуклеиновых кислот и других неиэомеразных протеиновых материалов иэ приведенной в состояние растворимости изоиеразы глюкозы до обработки сульфатом магния.

Способ, которым смешивающийся с водой органический растворитель добавляется в раствор, содержащий изоиеразу глюкозы, не содержащую клеток может меняться ° Один из способов включает первую обработку центрифугированной пасты из,клеток, которая содержит внутриклеточную иэомеразу глюкозы, частью используемого смешивающегося с водой раствори35" С, наиболее предпочтительно 2530 С. Типичной пригодной солью маг ния для осаждения является сульфат магния (гелтгидратная форма).

Количество водорастворимой соли магния должно быть ло крайней мере достаточным для обеспечения получения жидкости, содержащей водный шлам смешивающегося с водой органического

Растворителя и энзим изомеразы глюкозы, не содержащей клеток по крайней мере примерно 0,02 моль по отношению к иону магния. Верхний предел концентрации соли магния изменяется в зависимости от используемой соли. Соль магния не должна добавляться в такой степени, чтобы происходил общий эффект "высаливания" или отделения водносолевой фазы. Максимальное количество соли магния в растворе примерно 0,3 моль., Предпочтительно концентрация соли магния в растворе примерно 0,02-0,2 моль, считая на содержание иона магния., Наилучшие результаты получают при добавлении соли магния в количестве, обеспечивающем получение раствора примерно 0,05 по отношению к иону магния.

Продуцентами 1 для получения энзимами изомеразы глюкозы, препарата глюкозоизомеразы,является Streptomyces,olivochromogenes АТСС В 21713 и АТСС М 21715 (последний представляет собой простой иэолят колоний

35 АТСС и 21713) (5}.

Ниже приведены определения для упрощения текста.

Выражение " декстрозный элемент" (ДЭ) применяется для обозначения

40 снижения содержания сах".Ра в материале, Рассчитанного на декстроэу, и выраженного в процентах общего содержания твердых веществ.

Выражение "крахмальный гидроли45 зат" обычно используется для обозначения сиропа или сухого продукта, который получен гидролизом крахмала.

Такой продукт может быть получен, гидролизом в кислой среде или энзи50 матическим гидролизом или комбина" цией кислотного гидролиза и энзиматического гидролиза. Предпочтительный типа крахмального гидролизата для использования в изомеризации в соответствии с данным способом Ilo- лучают кислотным или энзимным раэбавлениеи до ДЭ 10 или меньше с по" следующим энэиматическим осахарива1024014 8 теля. Водный шламм из клеток и раст- ворителя затем обрабатывают таким способом, чтобы высвободить изоме.разу из клеток. Такие обработки включают звуковую обработку, обработку повторным замораживанием и оттаиванием, или обработку поверхностно-активными веществами, и/или литическими препаратами энзима, та кими как лиэоцим. Использование литических энзимов предпочтительно с точки зрения крупномасштабных операций. После высвобождения энзима иэ клеток в раствор добавляют до-. полнительное количество растворителя вплоть до момента, когда npo"" исходит осаждение нуклеиновых кислот и посторонних протеинов, но . энзим изомеразы остается растворимым. Затем удаляют остатки клеток и осажденные посторонние материалы.

В этот момент производится добавление водорастворимой соли магниясульфата магния с образованием преципитата стабилизированного концентрата энзима.

Другой способ использования растворителя включает добавление всего предварительно. определенного количества растворителя в клеточную пасту изомеразы глюкозы. Клеточную пасту, получаемую центрифугированией разводки клеток, содержащей внутриклеточную иэомераэу глюкозы, обрабатывают полным, количеством смешивающегося с водой органического Растворителя с водой для получения клеточного шлама из растворителя и воды.

Шлам, содержащий смешивающийся с водой органический растворитель, обрабатывают для выделения из клеток энэима изомеразы глюкозы. При последующем удалении нерастворимого материала, который содержит остатки клеток и нуклеиновые кислоты, осветленный раствор, содержащий изомеразу глюкозы, не содержащую клеток, растворитель и воду, обрабаты.вают. водорастаоримой .солью магния для осаждения стабилизированного концент- . рата энзима.

Условия в отношении температурй и рН во время этой обработки должны быть такими, что энзим не инактиви- . ровался. Обычно РН находится в пределах примерно б-9 и предпочтительно

7-7,5 во время каждой стадии процесса. Температура может быть примерно 5-55 С, предпочтительно 15

1024014

1 мл

1 мл д коза 1,44 r

Дистиллированная До получения вода полного объе- 50 ма 7,5 мл

Препарат энзима для анализа сна" чала разбавляется до содержания

1-6 ИЕИГ/мл.

Энэиматическая изомеризация производится путем добавления 1 мл препарата энзима в 3 мл исходного раствора и выдерживания в термостате в нием до ДЭ примерно 90, предпочтительно 95.

Термин "декстроза" обычно применяется в практике производства для обозначения рафинированного кристаллического сахара (моносахарида ), т,е. извлеченного из переработанного в высокой степени крахмального гидролизата.

-, 10

Термин "глюкоза" в контексте при-, меняется как в обычном производст-" венном значении, так и охватывает

1 ч моносахаридную декстроэу в любои фор ме, в растворе или в рафинированной кристаллической форме.

Выражения "фруктоэа" и "левулоза" обычно применяются как равнозначные для обозначения левовращающегося изомера глюкозы, который слаще декстрозы. Этот изомер обнаружен в натураль- 20 ном виде в меде и инвертном. сахаре вместе с глюкозой, и представляет определенную ценность вследствие своей сладости. Выражение "фруктоза" используется для обозначения этого 25 моносахарида. Выражение IGIU {Inter

nat1опа1 Glucose Isomerase UnIt) является сокращением выражения "Международная единица изомеразы глюкозы" (ИЕИГ) . Одна МЕИГ представляет собой количество энзима изомеразы глюкозы, которое образует один микромоль фруктозы в минуту в 0,8 M растворе глюкозы при рН 7,5 и 60 С при использовании методики анализа изомераэной активности. Последний включает проведение спектрофотометрического определения кетоэы, полученной иэ раствора глюкозы в стандартной совокупности условий.

Исходный раствор приготовляется следующим образом. Содержание компонентов:

091 И И9504 7.Н 0

0,01 М СоСД 6Н 0

1,0 И фосфатный буфер, рН75 05мл

Беэво ная О-глютечение 30 мин при 60 С. В конце периода выдержки берут аликвотную долю 1 мл и резко охлаждают в 9-миллилитровом объеме, 0,5 N хлорной кислоты. Охлажденную аликвотную долю затем разбавляют до общего объема

250 мл. Для контроля и сравнения производят также слепую глюкоэную пробу путем замены 1 мл воды 1 мл препарата энзима в форме раствора в начале периода выдержки в термостате. Затем производят определение кетозы методом цистеина и серной кислоты. Для этого МЕИГ определяется как количество энзиматической активности, которое необходимо для получения одного микромоля фруктозы в минуту в описанных условиях изомеризации.

Приготовление энзима лизоэима.

Энзим лиэозима (EC 3.2.1.17) представляет собой энэим, который гидролизует бета "1,4- связи между

И-ацетил-мурамовой кислотой (или

2-ацетоамидо-2-деокси-О-глюкозой остатками и 2-ацетамидо-2-деокси-0-глюкозы в мукополисахариде, мукополипептиде или в хитине). Лизозим обычно получают из яичного белка. Он каталиэирует гидролиз (лизис ) оболочек клеток многих микроорганяэмов.

Пример 1 А. Приготовление внутриклеточной изомеразы глюкозы.

Препарат энзима внутриклеточной изомеразы глюкозы, используемый для приготовления стабилизированного концентрата энзима, получают в течение четырех стадий развития посева, начиная с 1-литровой встряхивающей колбы и кончая 1000-галонными (3785,4-литровыми) посевными баками и 20006- галлонными{75708-литровыми ) ферментаторами. На каждой последующей стадии развития и 20000-галонные (75708-литровые 1 ферментаторы инокулируют с помощью объема nocesa равного 53 объема инокулированного сосуда. Состав среды для развития посева и рабочих методик приводится в табл.1. Среду для каждой стадии стерилизуют . в течение 30 мин при

120 С. Время инокуляционного развития 48 ч для первой стадии, 24 ч для второй стадии; 22 ч для третьей стадии и 15-17 ч для четвертой стадии. На первой стадии клетки из спорового штамма мутанта микроорганизма, определенного как Streptomyces

1024014

12 имеет 19.5 ИЕИГ/мг. Порцию разводки в 2340 галлонов -< 8857 9 л) отбирают для использования при приготовлении стабилизированного концентрата изомеразы глюкозы. Другую порцию разводки извлекают в виде целых клеток с помощью Ид(ОН), вспомогательного фильтрующего материала Sil-Г1о

332 и 2-пропанола. Извлеченные целые клетки затем используют для энзиматической переработки глюкозы во фруктоэу в конверторе периодического действия.

Состав среды для развития nocesa .приведен в табл.1.

Состав Среды дл 20000-галонных (75708-литровых) ферментаторов приведен в табл.2. Объем состава

17000 галлонов If64352 л).

Б. Приготовление концентрированного концентрата энзима иэомераэы глю козы. 2340-галонную (8857,9-литровую/ порцию разводки энзима внутриклеточной изомеразы глюкозы из

20000-галонного (75708-литрового ферментатора с активностью примерно

19,5 ИЕИГ/мл при общей величине

173х10 МЕИГ обрабатывают на центЬ рифуге, отбрасывающей твердые частицы. "Де Лаваль BPllX-207". Подачу материала на машину производят при скорости 5 галлонов (18,9 л) в минуту с 2-минутным циклоном выброса частиц. Промывочную и заливочную во" ду добавляют в течение 1 с до и после выброса из ротора центрифуги.

2023 фунта (917,,6 кг ) клеточной пас- ты с активностью 187 ИЕИГ/г, полу« ченной из ротора центрифуги помещают в 225-галлонный (о51,6-литровый) чан с круглым днищем вместе с 7,7 л воды. Когда собирается 650700 фунтов (294,8-317,5 кг) клеточной пасты, ее обрабатывают 8 г препарата энзима лизозима (2-х кристаллический, высушенный холодом порошок, приготовленный компанией "Иайлс.

Сирэвок" из яичного белка с активностью 23000 ед/мг материала) для того, чтобы разрушить оболочки кле-. ток и высвободить внутриклеточную изомеразу глюкозы в растворимой форме. В клеточную пасту добавляют раствор из 2-пропанола (853 по объему) и воды из расчета 5,6 галлона (21,2 л) раствора на 100 фунтов (43,36 кг) пасты, Дополнительно в смесь добавляют 11 галлонов (41,64 л)

2-пропанола и оды для доведения

ol 1 vochromogenes АТСС Р 21715, добавляют у питательной среде. Четыре стадии развития посева осуществляют .при 28 С и при рН 7,0 (с доведением до этой величины.до стерилизации с помощью 10 и гидроокиси натрия). Во время второй, третьей и четвертой стадии развития колбы и чаны подвергают продуванию воздухом и перемешиванию в течение ферментаций.

Конечные ферментации проводят в

20000-,галонных (75708-литровых ферментаторах) . Ингредиенты среды беэ ксилозы и декстроэы .единовременно помещают в 1400 галлонов (52996) кон- 15 денсата. После приготовления среду нагревают примерно до 60 С и доводят рН до 5,6-5,8 с помощью кальциниро-.. ванной соды 16 Боме. Разводку нагревают, доводя рН для отделения двуокиси углерода,. которая выделяется после добавления кальцинированной соды. После того, как.рН среды достигнет нужной величины, добавляют пеноудалитель и ферментатор и его содержимое стерилизуют в течение

30 мин при -120ОС. После стерилизации температуру. среды снижают до с о

60 С. Сахары., ксилоза и декстроэа, единовременно помещаются в 4000 ran- 30 лонов (1514 л) конденсата в 1000 галлонном(3785-литровый) посевной чан, Сахарный раствор стерилизуют в течение 30 мин при 120 С и после охлаждения сливают по шлангу в 20000--галонные j 75708-литровые) ферментаторы.

После добавления сахара температуру . ферментатора стабилизируют на рабочей величине 32 С, а затем ферментатор инокулируют посевной культу40 рой. Начиная с 20 ч после инокуляции каждые 2 ч отбирают и анализируют на иэомеразную активность, вес клеток, уменьшение сахара и всех карбогидратов образцы разводки фермен45 татора. Ферментация считается закон" ченной, когда производство энзима йзомеразы достигает пиковой величины. Во время ферментации рН удерживают 5,4-5,6 автоматически или вручную добавлением газообразного амми" ака через барботажные воздушные,линии ферментатора в условиях предварительной стерилизации.

Добавок кобальта не производится ни на одной стадии ферментации или 55 стадии развития посева.

Энзим внутриклеточной изомеразы глюкозы, извлеченный из разводки.24014

22,2

63,8

74,7

11,4

5,3

5,8

0,035

50 2-пропанол, по разнице,3

13 10 содержания спирта в жидкости до 303 по объему. Затем смесь, состоящую из пасты, 2-пропанола и воды, перекачивают в 1000-галлонный (3,785-лит" . ровый) варочный аппарат и процесс ведут в течение 24 ч. Температуру жидкости в варочном аппарате поддерживают примерно 26 С. После 24-часового дигидрирования смесь модифицирована добавлением 85Ô 2-пропанола до содержания 2-пропанола до 523 по объему, где нуклеимовые кислоты нерастворимы, а протеиновый энэимный материал растворим. Роторный вакуум" ный фильтр загружают предварительно . наносимым фильтровальным материалом

"Дайкзлайт 4200" в количестве 200 фунтов (90,7 кг). Когда предварительно нанесен слой фильтрующего материала, то в воду предварительного слоя добавляют 2-пропанол для доведения содержания спирта примерно до 523 по объему с тем, чтобы снова удерживать нуклеиновые кислоты в нерастворимой форме, т.е. для предупреждения приборостроения растворимости нуклеиновыми кислотами. 8 роторном фильтре с предварительно нанесенным слоем фильтрующего материала не осу" ществляют никакой промывки, но пред варительно нанесенный слой смеси во" да - спирт пропускают через фильтр после окончания фильтрации шлама пасты. Влам пасты, оставшийся в слое предварительно нанесенного фильтрующего материала, перекачивают на нутч" фильтр для удержания на минимальной величине, потерь энзима, Производят добавление фильтрующего материала

"Дайкелайт. 4200", чтобы способство-: вать фильтрации на нутч-фильтре. фильтрат из обоих фильтров роторного фильтра к предварительно .нанесенным слоем фильтрующего материала и нутч-фильтра перекачивают в 1000галонный (379-литровый ) чан, используемый в качестве хранилищной емкости для подачи в питательный чан, куда добавляют 15 гашюнов (56,78 л)

1,0 раствора малярного сульфата аммония (И (NH )S0p 7H Î) и 13 галлонов (49,2 л) 85i по объему 2-пропанола. Смесь подают на центрифугу.

"Де Лаваль БРПХ-207".при расходе .подачи 16,6 галлонов (62;8 л в минуту при 5-минутном цикле выброса.

После окончания центрифугирования ротор пять раз прочищают 1-секундным добавлением заливочной воды и прокручивают. Остаток, содержащий стабилизированный концентрат знзима, оставшийся в роторе и выбрасывающей камере, счищают и ротор и камеру промывают некоторым количеством легкой фазы, выгруженной иэ центрифуги. Остаток и промывочная жидкость переходят в продукт - стабилизированный концентрат знэима. Продукт перемешивают с,помощью лабораторной мешалки и помещают в 1-галонные (3785-литровые) пластиковые контейнеры для оценки и дальнейшего использования для знзиматического преобразования глюкозы во фруктозу.

Общий выход стабилизированного концентрата знзима.изомераэы глюкозы (загрузка и 1) 11 галлонов(41,64 л

s виде концентрированной жидкости,,со держащей 109xl0 МЕИГ или примерно

11,261 NEW/r на сухое вещество. Это составляет 633 извлечение общей активности, присутствующей в разводке целых клеток, использовавшейся в качестве исходного материала. более полный анализ стабилизированного концентрата знзима изомераэы глюкозы приводится ниже.

Загрузка Р 1

Изомеразная активность

ИЕИГ/r,-сухое вещество 11,261

Удельная активность, ИЕИГ/r,nðoòåèí

Сухое вео;атство, Ж

Влажность(Карл Фишер),3

Протеин (Къельдаль), I на сухое вещество

Вольная окись, Ъ на сухое вещество

Нерастворимое, сухое вещество, 3 на сухой основе

Hg, мг/мл

Ng /протеин, соотношение

Пример 2, Несколько загрузок знзима внутриклеточной изомеразы глюкозы, полученного из Streptomyces oltvochrogenees АТСС 0f 21715 1 приготавливают как в примере 1(А 1 с использованием 7,5-литрового, 40литрового и 400-литрового фермента15

1024014 торов для развития посевов и в

4000-литровом ферментаторе для окончательной стадии выращивания. .После ферментации температуру каждой из загрузок, содержащей целые клетки энзима внутриклеточной изомеразы глюкозы, снижают с 32 до 22 С для задержки дальнейшего роста микробов и возможного автолиза клеток. Загрузки разводки затем подвергают центрифугированию для концентрирования клеток с целью образования клеточной пасты. Тяжелофазную клеточную пасту собирают в 10-галлонных (37,8-литровых ) емкостях, взвеши- 15 вают и затем перекачивают в 1000-галлонный (3785-литровый) варочный чан для дигерирования клеток. В клеточную пасту добавляют при перемешивании препарат энзима (2-х кристалличес 20 кий высушенный вымораживанием порошок, изготовляемый компанией "МайлсСирэйвок" из яичного белка и имеющий активность 23300 ед/мг материала (для дигерирования оболочек клеток 25 и высобождения внутриклеточной изомеразы глюкозы в растворимой форме.

Дозировка лизоцима для каждой из загрузок 6,8 ед/мг клеток (на сухое вещество). Общий вес клеток (на сухое вещество), присутствующих в клеточной пасте, рассчитывают с использованием конечного веса сухих клеток всей разводки ферментатора и объема разводки ферментатора. Это предполагает 1004-ное извлечение клео

35 ток на сухое вещество на стадии начальной концентрации. Лизоцин добавляют в клеточную пасту после центрифугирования всей целой разводки и

40 перед добавлением какого-либо спирта к клеточной пасте. После добавления лизоцима добавляют 2-пропанол для получения концентрации 42+13 по весу. Первоначальное добавление 2-пропанола рассчитывается на основе веса

45 клеточной пасты минус 8 на нераст воримые вещества (на сухой вес) и свойства подаваемого спирта.

В четырех загрузках осаждение производят периодически с использованием питающего чана для отстойника. Осветленные фильтраты периодически помещают в чан 1в каждом опыте) объемом примерно 170 галлонов (633,45 л ). K этому добавляют 1,0 М раствор MgSO при дозировке 0,05 галлона 1,0,189 л) на галлон (3,785 л) осветленного лизата и объем азеотропического 2-пропанола для поддержания общего уровня пропанола примерно 423 по весу. Во время добавления растворы перемеши-,; вают и,рециркулируют питательным насосом для облегчения перемешивания.

Осажденный энзим выдерживают в течение 10-15 мин, чтобы дать ему агломерироваться в крупные хлопья, а за-. тем извлекают центрифугированием с использованием центрифуги "Де Лаваль

БРПХ-207". Раствор подают на центрифугу при расходе подачи 6-10 г/мин.

В одной загрузке (загрузка И 10) осаждение проводят непрерывно с использованием питательного чана в качестве реактора с непрерывным пере" мешиванием. Осветленный лиэат и раствор MgSO непрерывно подают дозой в питатель через смесительный тройник.

Концентрацию 2-пропанола осветленного лизата доводят до 44".„-453 по весу для компенсации при растворении раствором MgSO<,т.е. поддерживая во время осаждения содержание спирта 4ЬФ 4.

Поток осветленного лизата регулируют с помощью регулятора расхода. 1 М ра; створ М9804 подают при расходе подачи 0,05 галлона (0,189 л} на галлон (3,785 л) осветленного лизата с использованием для этого небольшого диафрагменного насоса ° Осуществляют перекачку обоих растворов и в питательном чане создают нужный уровень.

После окончания центрифугирования. соответствующих загрузок остаточный энзим удаляют с поверхности центрифуги дистиллированной водой и смешивают с продуктом стабилизированным концентратом энзима. Каждую из извлеченных эагрузок стабилизированного концентрата энзима перемешивают до гомогенной, разливают в бутылки и хранят при 4ОC.

В табл. 3 и 4 приводятся данные об эффективности извлечения энзима на каждой стадии процесса. В табл.4 приводится анализ стабилизированных концентратов энзима. п р и м е р 3. Загрузку энзима внутриклеточной изомеразы глюкозы, полученного из Streptomyces ollvoch-, romogenes АТСС lI" 21715, приготавливают по примеру 1(А) с использованием 1-литрового, 14-литрового, 50-галонного (189-литрового) и 1000галонного (3785-литрового) фермента- . торов для высевки и развития посева и 20000-галлонного (75708-литрового) ферментатора 1ля окончательной стаг

17 1024014 дии выращивания. После завершения э ферментации разводку в 20000-галон- р ном 175708-литровом) ферментаторе м о охлаждают до 20 С. Ее выдерживают щ

:беэ продувания воздухом и перемеши- g u вания в течение."коротких периодов времени перед концентрацией клеточII ных твердых частиц. Конечная разводка (16000 галлонов или 60565 л) У имеет активность 21,0 ИЕИГ 1,грамм 1ц л разводки) максимальный выход по су- з хим клеткам 16,5 г/л и общую ак" тивность 1270,7х10 ИЕИГ.

Sce разводку, содержащую внут- Р риклеточную иэомераэу глюкозы, кон.- И Р центрируют центрифугированием на с центрифуге "Де Лаваль БРПХ-207" т для концентрирования клеточных твер . дых частиц при рабочем расходе по- ч дачи примерно 5,0 галлонов 1 19 л ) 20 и в минуту при коротком времени выб- м расывания 1,75 мин.. Легкофазный переливающийся продукт периодически д анализируют и выбрасывают. Выбросы д тяжелофазной клеточной пасты соби- 25 э рают в приемном бачке, а затем мел прерывно перекачивают в один из и трех чанов, которые используют для ц дегидрирования, Стадия концентриро" вания дает в результате примерно щ д

6,4-кратную концентрацию клеточных 1 твердых частиц 1,в расчете на объем).

Общее количество извлеченной клеточной пасты 2500 галлонов (9463,5 л) и весом 20709 фунтов (9393,4 кг) при общем весе сухого вещества 2431 фунт (1102,6 кг). Анализ клеточной пасты показывает наличие 289 фунтов 3 (131,09 кг) золы, 1433 фунта1649,99кг протеина, 18278 фунтов .(8290,76 кг) 40 воды,,активность 132 МЕИГ/г и: общую активность 1240,0х10 ИЕИГ (983 от общей активности). Н

Когда объем клеточной пасты в варочном чане достигает 200 галлонов ф5 (757 л) производят добавление в шлам

200-230 галлонов (757-870,6 л) . 91,53-ного 2-пропанола до заполнения варочного аппарата. После каждого. добавления спирта проверяют рН получаемого шлама в соответствующем варочном аппарате и доводят до 7,0-7,2 при необходимости с по-. мощью безводного первичного кис" . лотного фосфата натрия. После первоначального добавления спирта в соответствующие чаны производят добавление в возрастающих количествах нзима лизоцима по всему балансу пе-, иода заполнения при дозировке приерно 6,8 ед/мг клеток (wa сухое веество). Использовавшийся лизоцим редставляет собой 2-х кристалли- еский высушенный замораживанием орошок, изготовляемый компанией

Иайлс-Сирэйвэк" из яичного белка с казанной активностью 23000 единиц изоцима на миллиграмм препарата энима.

После того, как каждый чан заполнен, производят окончательное егулирование для доведения концентации спирта в шламе до 42+1/, по веу. Лиэат (шлам, состоящий из спира, клеточной пасты и лизоцима) посоянно перемешивают и рециркулируют ерез наружные теплообменники для оддержания нужной температуры. В ежтрубную зону теплообменников одают охлажденную воду для подержания температуры лиэата в преелах 28-30:С. Степень растворимости нзима проверяют сравнитепьным анаиэом энзима всего образца лизата части того же образца, иэ которого ентрифугированием удаляют клеточные вердые частицы. Когда дигерирование энного аппарата достигает примерно

ООФ сольватации, шлам лиэата легко светлить для удаления остатков клеок. Время дигерирования составляет римерно 52-73 ч, считая со стадии аполнения. Весь шлам лизата,иэ рех варочных аппаратов имеет общий объем 5138 галлонов(19944,94 л) вес

9590 .Фунтов (17957,72 кг) и общее оличество сухого вещества 2247 фунов (1019,2 кг), Анализ шлама лизата показал наличие 414 фунтов(187,78 кг) олы, 1431 фунта (649,09 кг) протеиа, 15920 кг (7221,2 кг) 2-пропанола и 21423 (9717,3 кг) воды. Лизат имеет единичную активность 66,6 ИЕИГ/г и общую. активность 1178,9xlO ИЕИГ что составляет 934 первоначальной общей активности разводки ферментации.

Ц1лам лизата осветляют с помощью фильтра с предварительно нанесенным слоем фильтрующего материала "Дайкэлайт Спидфлоу" (производимый компа" нией Грефко Инкорп") толщиной 2,252,5 дайма. Для осветления шлама лизата используют в целом 600 фунтов (272,16 кг ) фильтрующего материала.

В шлам для предварительного слоя добавляют 50-ный раствор 2-пропанола при концентрации 54. Для сохранения

1024

014

19 свежего раствора для нанесения предварительного слоя, когда предварителы ный слой нанесен, нижнюю 1асть предВарительного слоя по капле сливают обратно в резервуар для свежего материала для предварительного слоя.

Немедленно после слива нижней части предварительного слоя дигерированный шлам лизата направляют на фильтр.

Скорость фильтрации для стадии ос- 10 ветвления изменяется от 2,6 галлонов/ч фут до 3,9 галлонов/ч-фут (9,8 л/ч0,093 м -14,76 л/ч -0,093 м )при средней скорости пропускания материала 2,9 галлона/ч-фут(10 97л/ч- :

" 0 093 м). После фильтрации осветленный фильтрат перекачивают в

1000-галлонные .(3785-литровые) хранилищные емкости. Вырезки фильтровальйой лепешки из фильтра перно" дически подвергают анализу и выбрасывают. Весь лизат имеет объем

4638 галлона (17556 7 л), вес .35716 фунтов (16200,5 кг) при общем весе сухого вещества 774 фунта (351,08 кг). Анализ осветленного лизата показал наличие 106 фунтов (48,08 кг) золы, 492 фунта(223,17 кг) . протеина, 15798 фунтов (7165,9 кг)

2-пропанола и 19122 фунта (8673,59 кг) воды. Единичная. активность осветленного лизата 54,0 ИЕИГ/г, а об-" щая активность 875,7xlO ИЕИГ, что составляет 6Я. первоначальной активности из ферментационной разводки, 35

После стадии осветления концент" рацию осветленного лизата в отдельных чанах увеличивают до 44-451 по весу (определялась rio удельному весуперед обработкой по всем стадиям 40 осаждения,и стабилизации). Осаждение и стабилизация.энзима иэомеразы глюкозы в растворе осветленного лизата осуществляется непрерывной дозированной подачей осветленного лизата и 2,2 И раствором ISO< и

941 фунта (426,8 кг) воды через смеситепьный тройник ("Т") в..питающий чан, который соединен с центрифугой

"Де Лаваль БРПХ-207". 2,0 И раствор,З0 сульфата магния добавляют при расходе подачи 0,025 галлона на галлон (0,.0946 л на 3,785 л) осветленного . лизата для обеспечения конечного раствора с 0,05 И концентрацией

ISO+. Пускают поток раствора

HgSQ, раствора осветленного лизата и в питающем чане создают нужный уровень. Чан заполняют до объема, который при данных расходах подачи дал время пребывания в 15 мин.Затем смесь подают на центрифугу при расходе эквивалентном расходу подачи в питающий чан. Расход подачи на центрифугу регулируют таким образом, чтобы поддерживать уровень постоянным (и время пребывания также постоянным, т.е. примерно 15 мин) в питающем чане

Перетекающий из центрифуги продукт направляют на 8000-галлонный (30283-литровый) резервуар и дополнительно обрабатывают для извлечения

2-пропанола: для повторного использования. Стабилизированный концентрат энзима собирают в 20-галлонных (75,7"литровых) емкостях из нержавеющей стали, .а затем смешивают в 100галлонной (379-литровой) емкости с перемешиванием. Стабилизированный концентрат энзима имеет средне-коричневый цвет. Производят периодичесаэе .добавление воды для стабилизации концентрата энзима и для обеспечения повторной растворимости энзима, если это требуется (повторная растворимость определяется визуально).

Когда добавляется дистиллированная вода и стабилизированный концентрат энзима растворяется, цвет его переходит в относительно светлый кофейный цвет. и его консистенция соответствует консистенции светлого нефтепродукта.

Извлеченный стабилизированный (в повторно растворимой форме) концентрат энзима имеет объем 73 галлона (276,3 л), вес 634 Фунта 287, 57 кг ) и сухого вещества 169 фунтов (76,66 кг)

Анализ стабилизированного концентрата энзима показал наличие 19 фунтов (8,6 кг) .золы, 126 фунтов (57,15 кг) протеина, 104 фунта (47, 17 кг) 2-пропанола и 360 фунтов (163,29 кг) воды.

Стабилизированный концентрат энзима имеет единичную активность

11,654 ИЕИГ/г (на сухое вещество) и общую активность 892,8х10 ИЕИГ/г, что представляет 70,33 выхода извлечения общей активности всей клеточной разводки, использовавшейся в качестве исходного материала при мак" симуме потерь (23-24 ), происходящих на стадии осветления лиэата.

Из этого количества около половины (примерно 11,8",) может быть отнесено

В табл, 5 (загрузка 11) приведены сведения об эффективностях извлечения энзима на всех стадиях обработки. В табл. 6 приводятся результаты анализа стабилизированного концент1 рата энзима, Удельная активность, ИЕИГ/мг, протеин

Сухое вещество,3

15 5

26,6

Влажность(Карл фишер), 4

Протеин, Кьельдаль!3 . сухое вещество

Зольная окись 3 ° сухое вещество

56,9

75,0

- 11 3

Нерастворимое сухое вещество,3, сухой вес

0,53

5,99

Mg, мг/мл

Конечный аес извлеченного энзима, кг на сухое вещество 287.58

Данные, приведенные в табл,6 указывают на то, что стабилизированные концентраты энзима могут сохранять более чем 80 103 (и обычно больше чем 90+10 f своей первоначальной изомеразной активности до 12 мес при хранении при 4 и 18 С и способны сохна вырезки фильтровальной лепеш" ки.

Пример 4. Несколько образ" цов извлеченных стабилизированных концентратов энзима изомеразы глюкозы по примерам 1-3 и другие по" добные образцы подвергают испытаниям для определения. их стабиль" ности при хранении при различных тем пературах. Образцы хранят при 4, 18, 26 и 37 С и анализируют на изомеразноглюкозную активность с интервалами в 4,8 и 12 месяцев.

Ниже приведен анализ стабилизированного концентрата знзима изомеразы глюкозы загрузки Ol 11-336

Изомеразная активность, ИЕИГ/г, сухой 11654

Mg молярный 0 25

Ис протеин, соот- w0,032 ношение 2-пропанол Ф (по разнице) 16,5

1024014 22 ранять до 80" 10/ своей первоначальной изомеразной активности до 8 мес при хранении при 26 С, т.е. стабилизированные концентраты энзима проявляют в среднем менее чем 5/ потерь первоначальной изомеразной активности при хранении при 4 С в течение 12 мес, среднюю величину потери менее чем примерно 15 своей nept0 воначальной активности при хранении а течение 12 мес при 18 и 26 С.

Пример 5. 17-галлонную (64,35-литровая) загрузку разводки, содержащей внутриклеточную изоме!

5 разу глюкозы, приготовленную по примеру 1(А ), разбавляют водой и центрифугируют для получения клеточной пасты. 17-галлонная загрузка разводки взята из двух загрузок 1О-галлон2О ного (37,853-литрового) ферментатора с активностью 18,0 ИЕИГ/мл и l6,8 ИЕИГ/мл соответственно. Обе загрузки смешивают для использования при приготовлении клеточной пасты. у5 Полученную при центрифугировании лепешку (клеточная паста } помещают в

5,5"литровый бродильный сосуд и разбавляют водой до получения общего объема шлама 4,5 л. Шлам, который

>0 хранился при 4 С а течение двух дней, обрабатывают 77 мг препарата энзима лизоцима (полученного из яичного белка, имеющего примерно 8000 лизозимных ед/мг) и 1930 мг 2-пропанола, Влам перемешивают а течение 4 ч, после чего производят добавление

500 мг препарата. энзима лизоцима.

Шлам перемешивают в течение ночи с регулированием температуры до 2040

30 С (температура увеличивалась примерно на 35-40 С после второго о добавления лизоцима, которое вызвало некоторую дезактивацию энзима).

После дигерироаания 500-миллиметровый образец разбавляют.500 мл 5 воды. 123-миллилитровые аликвотные доли разбавленного лизата доводят примерно до 503 2-пропанола (в расчете на объем/объем) путем добавления 2-пропанола. Одна алик50 вотная доля лизата используется для контроля. К каждому аликвотному образцу лизата добавляют указанные (в табл.7) количества хлористого натрия (для сравнения) и сульфат геп55,тагидрата магния (MgS04 7Н О). После добавления соли, суспензии, включая и контрольную центрифугируют и анализируют на изомеразно23

1024О14

24 глюкозную активность и содержание протеина.

Приведенные в табл.7 результаты показывают, что добавление соли суль, фата магния в лизат спирт вЂ” вода приводит к снижению изомеразной активности во всплывающем слое без существенного уменьшения содержания нуклеиновой кислоты во всплывающем слое (нуклеиновые кислоты поглощают свет при 260 нм). Этот эффект не имеет места при добавлении соли хлористого натрия. Следовательно, добавление соли сульфата магния в лизат из спирта и воды вызывает выделение изомеразы глюкозы из растворимых нуклеиновых кислот.

Наблюдавшееся явление очевидно не было типичным эффектом "высаливания", так как уровень сульфата магния был слишком низким, а результат при хлористом магнии был противоположным. Эксперименты с хлористым натрием не вызывали какого-либо cy" ,щественного снижения изомеразной активности во всплывающем слое.

fl р и м е р 6. Для сбалансирования 4,5 л сырого лизата (содержащего изомеразу глюкозы с приданной растворимостью) из примера 5 производят добавление вспомогательного фильтрующего материала и достаточно" го количества 2-пропанола для того, чтобы превратить шлам в 50> по отношению к 2-пропанолу в объемном отношении (объем/объем). Шлам медленно профильтровывают до осветления растворенной изомеразы глюкозы. Анализ 335-миллилитрового образца фильтрата показывает 65,2 МЕИГ/мл (общее

21,842 МЕИГ). В этот образец добавляют 16,5 мл 2-пропанола и 16,5 мл одномолярного раствора сульфатгептагидрата магния (Мц50 7Н О) при рН 8. После добавления соли немедленно образуется маслянистый преципитат. Раствор, содержащий преципитат, центрифугируют и преципитат удаляют.

Преципитат повторно растворяют водой до общего объема 10,5 мл. Этот образец разбавляют водой до общего объема 10,5 мл. Образец разбавляют водой до 402 к 1 и светопропускаемость разбавленного раствора при

260 и 280 нм составляет 0,284 и

0,350 соответственно. Анализ раствора показан 2040 МЕИГ/мл. Следовательно, его общая активность 21400

МЕИГ (98> начальной активности, ф5

ll р и м е р 8. 3250 мл осветленного лизата, содержащего растворенную иэомеразу глюкозы, имеющую

109 МЕИГ/мл ив первоначальной 4,5= литровой загрузки, указанной в примере 5, смешивают со 162 мл раствора 2-пропанола и 162 мл раствора одномолярного сульфатгептагидрата магния ° Немедленно образуется маслянистый осадок, который собирают центрифугированием, Преципитат имеет объем 69 мл.его анализ показал

4,040 МЕИГ/мл при общей величине

278,760 МЕИГ,. Для анализа производят 1-1000-кратное растворение небольшой части стабилизированного концентрата энзима. Его светопропусполученной из осветленного лизата).

Стабилизированный концентрат энзима, изомеразы глюкозы имеет удельную активность 15,3 МЕИГ/мг протеина..

Таким образом сульфат магния селективно осаждает и очищает энзим изомеразы.

Il р и м е р 7. 67-миллилитровый образец повторно раствбренного фрак10 ционата спирта, содержащего растворенную, не содержащую клеток изомеразы глюкозу, перемешивают с 67 мл раствора 2-пропанола. Не наблюдается никакого преципитата . После этого производят добавление 2 мл одномолярного раствора сульфатгептагидрата магния и 2 мл раствора 2-пропанола для осветления,водно-спиртового раствора, содержащего иэомеразу. Немедленно . после этого .образовался серо-белый твердый преципитат, который извлекают и растворяют в воде до объема 13,0 мл. Стабилизированный концентрат энэима повторно цент25 рифугируют и разбавляют водой до

10 1 к 1 для,проведения количественного анализа. Светопропускаемость разбавленного раствора при 260 м и

280 нм 0,288 и 0,437 соответственно.

Содержание протеина разбавленного раствора определяют в 0,46 мг/мл.

Следовательно, неразбавленный раствор, включающий растворимый, стабилизированный концентрат энэима, со35 держит 46,5 мг/мл протеина, анализ которого показал 482 МЕИГ/мл и удельную активность 10,4 МЕИГ/мг протеина. Общая активность в 13,0 мл стабилизированного концентрата энзиф) ма 6,266 МЕИГ. Отцентрифугированный материал содержит всего 150 МЕИГ.

14 . 26

Два образца из 200-миллилитрового стабилизированного концентрата» энзима подвергают испытаниям на стабильность при хранении при кома натной температуре (примерно 26 С ): с последующим проведением повторного анализа. В начале испытанйй на стабильность при хранении оба образца имеют примерно 3300 ИЕИГ/мл, Образцы периодически анализируют и на 31 день хранения образец вместс с добавленным предохранительным средством показал при анализе

3165 ИЕИГ/мл, а другой образец (беэ предохраняющего средства) 3140 ИЕИГ/мл

Таким образом, стабилизированные концентраты энзима(c предохраняющими средствами или без него) одинаково стабильны при хранении и способны сохранять до или больше 954 своей первоначальной активности в течение более 30 дней при хранении при комнатной температуре.

Пример 10. Сравнительные эксперименты. Цель экспериментовпоказать эффективность используемых различных водорастворимых солей магния в соответствии с изобретением

s сравнении с другими слоями, спос©бными осаждать протеины, такие как сульфат аммония, сульфат нат" . рия и хлористый натрий. В сравнительных экспериментах использовались также и другие двухвалентные соли.

Крупный образец лизата (раствор

Из спирта, воды и изомеразы глюкозы7 из загрузки Ю 6 (пример 2 и: табл.3), центрифугируют на лабораторной центрифуге при скорости вращения

18000 об/мин в течение 10 мин до использования: СодерЖание спирта- оп" ределяют в 41,63 по весу или 49,33 (объем/объем). К каждому из несколь" ких .30-миллилитровых образцов осветленных лизатом (при комнатной температуре), после этого добавляют указанное количества 1 И раствора солей, приведенных в .табл.8 вместе с эквивалентным объемом 2"пропанола.

После добавления соли и спирта образцы смешивают и затем центрифугируют при скорости вращения 18000 об/мин

s течение 10 мин. Всплывающие слои удаляют и преципитаты промывают из трубок центрифуги и разбавляют до

25 @л кобальто-фосфатным буфером (1о=И. Со+, рН 7,5) для анализа на иэомеразно-глюкоэную активность и определение протеина. Эффект раэлич25 10240 канне при 260 и 280 нм 0,315 и 0,345 соответственно. Содержание протеина

0,299 мг/мл, удельная активность

13,5 ИЕИГ/мг протеина, Балансовому количеству стабилизированного концентрата энзима дают отстояться в течение 48 ч после чего образуется три слоя. Трехслойный шлам центри" фугируют и подвергают анализу.

:18,2-миллилитровый верхний (липоид- 10 ный) слой имеет 565 ИЕИГ/мл, 39-миллилитровый средний слой - 1970 ИЕИГ/мл и 36-миллилитровый слой - 50,80 ИЕИГ/мл

Нижний слой обладает наиболее низкой светопропускаемостью при 260 нм . 1 и наиболее высокой при 280 нм. Верх" ний. слой имеет наиболее высокую сЮетопропускаемость при 260 нм.

Пример 9. 27,5-галлонную за" грузку разводки, содержащую17,5 ИЕИГ/мл внутриклеточной изомеразы глюкозы, приготовленную по примеру 1 (A), смешивают с равным ко" личеством воды и центрифугируют до образования лепешки. Лепешку смеши- 2 веют с водой до объема 26 л при рй

7,45, К этому раствору добавляют .

0,250 r лиэоцима и 11,5 л 2-пропа нола при 27 С. Добавляют небольшой количество противопенного агента и шлам перемешивают. 37,5-литровая водная суспензия содержит 3744 ИЕИГ/мл. После 20.,5 ч извлекают две 8-литровых аликвотных доли, пос" ле чего добавляют 2-пропанол в таком количестве, чтобы довестй объем

3$ до 50Ф в объемном соотношении объем на объем)..Производят добавление вспомогательного фильтрующего мате риала Сил-фао" (3 r/ã клеток) к

40 шламмам, которые после этого фильтруют и промывают 2 л 503-ного 2-пропанола. Анализ фильтрата показал

15 ИЕИГ/мл. Добавляют при первмешивании дополнительно 1 г лизоцима в 21,5-литровый баланс сырого ли"

43 эата с получением 24,3 ИЕИГ/мл,Содер жащийся в фильтрате энзим немед" ленно осаждают в фильтрат с добавлением 1,1 одномолярного раствора сульфата магния и 1,1 л о

2-пропанола. Преципитат, содержащий стабилизированный концентрат энзима, извлекают центрифугированием и растворяют в небольшом коли" честве водыдо полученияобъема 200 мл, $5 имеющих примерно 3450 ИЕИГ/млили вце лом 690000 ИЕИГ и удельную а ктивност ь примерно 12,5 ИЕИГ/мл протеина;

24014

27 10 ных солей и концентрации, оказываемый на селективное осаждение и очистку растворимого энзима изомеразы, .приведен в табл.8.

Результаты, приведенные. в табл.8 показывают, что сульфат натрия и сульфат аммония не осаждает энзима иэомераэы глюкозы иэ лизата так же эффективно и при такой же, низкой концентрации, как соли магния. Сульфат аммония не осаждает никакого энзима, .а сульфат натрия обеспечил только 194-ное извлечение энзима иэомеразы глюкозы. Это извлечение не обязательно происходит за счет осаждения и может быть отнесено за счет фазового разделения (фаза спирт-. вода и соль -. вода) . Протеин более растворим в соляно-водяной фазе, чем в. фазе спирт - вода. Соляно-водяная фаза не дает .специфического экстрагирования протеина из водо-спиртовой фазы . Так как соляно-водяная фаза более плотная, то она собирается как продукт. Другая испытанная моновалентная соль, хлористый нат-, рий, также не дает осаждения энзима изомеразы глюкозы.

Двухвалентные соли, иные нежели соли магния, дают осажде ие энэима изомеразы глюкозы, но степени извле- . чения и чистоты не эквивалентны степеням извлечения и чистоты, получен" ным при использовании солей магния.

Соли бария и стронция дали лучшие результаты иэ числа испытанных немагниевых солей, но использование этих солей нежелательно в кормах.

Иэ испытанных солей только соли магния эффективно осаждали энзим с высокой удельной активностью. Использовавшаяся концентрация солей магния представляет. собой небольшую часть .той, что требовалась для осаждения протеина из водного. раствора с использованием обычных способов выщелачивания, т.е. с использованием сульфата аммония и натрия.

Иэ данных, приведенных в таблице

8, также видно, что при увеличении концентраций сульфата магния (выше

0,08 моль) удельная активность уменьшается, что указывает на более беспорядочное осаждение протеина энэимом изомеразы глюкозы. Наблюдалось, что фазовое разделение происходило при использовании сульфата магния.

Понижение удельной активности следовало за явным увеличением растворимости протеина в соляно-водяной фазе. При использовании хлористого магния и ацетата магния не происходит никакого разделения фаз и удель.we активности остаются постоянными если не происходило увеличения, как в случае хлористого магния.

Иммобилизация растворимой изоме10 разы глюкозы.

Пример 11. В данном примере показано; что очищенный и стабилизированный концентрат энзима способен производить иммобилизированную

15 изомеразу глюкозы с более высокой связующей способностью, чем известная изомераэа, Известный препарат иэомераэы глюкозы приготавливают из внутри20 клеточной изомераэы глюкозы, содержащей целые клетки, приготовленной способом по примеру 1(А). С тем, что" бы способствовать извлечению целых клеток, в разводку добавляют вспомо25 гательный фильтрующий материал

"SiI-F.lo" и Mg(0H)< и смесь затем промывают 2-пропанолом, высушивают и измельчают на мельнице Уилея. Во время экстрагирования иэомеразы

З0 глюкозы иэ клеток смесь, содержащую клетки, обрабатывают MgS0y в количестве, достаточном для превраще" ния шлама в 0,01 И относительно соли магния, а рН доводят до

8,0 с помощью О, 1 И гидроокиси ка35 лия (КОН). Сырой энзим изомеразы глюкозы экстрагируют иэ 6,5-граымового образца (как основы)препарата сухих клеток с помощью 50 мл

40 экстрагирующего агента. Смесь перемешивают в течение 45 мин при комнатной температуре, а затем центри фугируют при 4 С. Получают экстракт, содержащий 26-27 ИЕИГ/мл. Раствор энзима изомеразы глюкозы, получен45 ныи этим способом и стабилиэирован" ный концентрат энзима, приготовленный в .соответствии с примером 1(В ), сорбируют на разнообразных водонерастворимых носителях с испольэова50 нием следующей методики.

В 150-миллилитровом химическом стакане 2 г (на сухое вещество) водонерастворимого носителя смешивают с 30 мл раствора, содержащего 0,1 M

55 MgSQ 7Н О и рН доводят до 8,0 с помощью КОН. В эту смесь добавляют достаточное количество жидкой иэомеразы (или изомеразы с нормально

14 рузную патоку с высоким содержанием фруктозы непрерывным пропусканием раствора глюкозы через биокатализатор, который может быть размещен в колоннах или в листовых (патронных) фильтр-прессовых элементах.

Из табл. 9 видно, что максимальная связываюшая способность, достигнутая с использованием изомеразы глюкозы с нормально приданной растворимостью, составляет 936 ИЕИГ/г при Селектацеле типа 40, который обладал обменной способностью 0,89 meg/r имел несколько более низкую связывающую способность, чем тип 40-, тип 20 является более практичным для промышленного использования, так как имеет более крупный размер частиц и, следовательно, дает лучшие расходы потока.

Пример 12. При проведении этих экспериментов стабилизированный концентрат энзима был иммобилизован на ряде водонерастворимых носителей и испытан на использование в непре"

pbtBHoH энзиматической переработке глюкозы в кукурузную патоку с высоким содержанием фруктозы.

Используют колонки, приготов« ленные путем помещения в основании колонки набивки из стекловаты и частичногб заполнения колонки водой. В случае использования водорастворимых носителей в эту колонку добавляют водорастворимые носи- . тели и накрывают набивкой из стекловолокна, Стабилизированный концентрат энзима 1загрузка 1, пример

1 8) затеи медленно пропускают через колонку с последующей промывкой небольшим количеством дистиллированной воды. Промывная вода и выходящие из колонки потоки смешивают и подвергают анализу. на изомеразоглюкоэную активность. Количество сор. бированного энзима определяют по разнице.

8 случае иммобилизованных целых клеток (продукт примера 1 А, содержащий вспомогательный фильтрующий материал "Сил-Флоу") в колонку ,соответственно добавляют 5 r препарата энзима, содержащего целые клетки, со 100 мг Hg(OM) и без таковой.

Колонки покрывают сверху набивкой из стекловаты.

Непрерывные переработки проводятся посредством непрерывного питания колонок 503 "бесцветной как вода" повторно растворенной крис29 10240 приданной растворимостью или кон» центрат энзима.соответственно насто" ящему изобретению) для контактиро- . вания носителя с 1,000-3,000 ИЕИГ изомеразы (в зависимости от емкости .носителя). После этого добавляют дополнительно 0,01 И раствор HgSOy для обеспечения получения жидкого объема 50 мл. Затеи смесь, содержащую энзим и водонерастворимый 10 носитель, тщательно перемешивают в течение 30 мин фильтруют и промыва/ ют 0,01 И раствором HgSOy 7H O.

Смешанные фильтрат и жидкости помещают в 250-миллилитровую мерную кол- fS бу, разбавляют до нужного объема с помощью 0,01 И раствора Ид504 7Н О и снова производят анализ первоначального растворимого препарата энзима изомеразы на изомеразную активность с использованием анализатора нТекнишэл Ото Энэлизер" (" ТесЫ ci an

Auto AnaIyzer") Связующая способность(СС ) для соответствующих водонерастворимых носителей рассчитана по разнице с использованием следую" . щей формулы СС, ИЕИГ/г, сухое вещество - общее наличие ИЕИГ - общее ИЕИГ в фильтрате и промывках.

В табл. 9 представлены результаты этого эксперимента, сравнивается связующая способность при различных носителях с изомеразой глюкозы с нормальной приданной активностью со стабилизированным концентратом энзима соответственно настоящему изоб"

35 ретению.

Данные, приведенные в таблице, показывают, что связующая способность

ДЭАЭ-целлюлозы примерно в два раза больше для стабилизированного концентрата энэима, чем для энзима с нормально приданной растворимостью, а в случае синтетических анионообменных смол в 2-3 раза больше. Установлено что связующая способность ДЭАЭ-цел 45 люлозы для стабилизированного концентрата энзима увеличивается предварительной обработкой носителя при более низком уровне рН. Например,при рН 6,5 носитель связывает 3I20 МЕИГ/г, >о тогда как необработанный носитель связывает только I6,34 ИЕИГ/г. При использовании данного стабилизированного концентрата стало возможным связать 10,9 млн ИЕИГ/фут (0,028 м) ss на ДЭАЭ-целлюлозе типа 20. Этот био катавизатор затем может использоваться для переработки глюкозы в куку102401431

32 ее%ьенеодГ; ее

i%Ье-%ьJ

Таблица1

3,6 (7,2г

1-я стадия (Три

1-литровых встряхивающих колбы}

Жидкость для замочки кукурузы, Код Е801

200 мл

15 ДЭ. Твердые вещества кукурузной патоки

«ее»

1,0 (2,0 г) таллической декстразой (600 г/л раствора), содержащей 0,004-0,0055 M сульфат магния при рН 8.,4-8,6. В случае необходимости эти колонки уравновешивают, и непрерывная энзоб меризация проводится при 60 С перекачкой воды при 60 С через рубашку колонны. Поток питания через колонку поддерживают сочетанием вакуума в основании колонки и газообразным азотом в питании. Расход потока регулируют изменением давления газа в питании.

Кажущаяся энзимная активность (K3) определяется с помощью уравнения где BVH - скорость расхода в колонке в объемистости слоя/ч, 4 Le - величина равновесия декстроза-фруктоза, которая при 60 С . составляет 51,2;

» Е = 4 кетозы в выходящих потоках колонки.

Объемы слоя/ч при 45» левулозы, 8VH =КЭ/0,916.

Молупериод, т.е. время, требуемое для уменьшения до половины кажущейся активности колонки, опре-. деляется отбором образцов в течение двух или более недель работы колонкй и измерением КЭ. Полупериод определяется по крутизне линии, определяемой методом наименьших квадратов, на графике tg КЭ относительно времени. При этом методе. предполагается, что скорость распада энзима первого порядка. Начальные объемы слоя/ч при 45» кетозы, BVH определвлась по пересечению линии наименьших квад-. ратов.. Эффективность определялась с помощью уравнения: Эфф.=BVH <<

Результаты этих непрерывных переработок с использованием различных препаратов иммобилизованного энзима глюкозоизомеразы представлены в табл.10. ,Приведенные в табл. 10 данные по- казывают, что стабилизированный концентрат энзима может быть эффективно сорбирован на многих водонерастворимых носителях и может использоваться для непрерывной переработки глюкозы в кукурузную патоку с высоким содержанием фруктозы. Наилучшим использованием энзима было сорбирование стабилизированного концентрата энзима на носителе из регулируемой пористой окиси алюминия.

Высокая степень использования энзима является результатом высокой эффективности и длительного полупериода..

Носители из основного карбоната маг20 ния и синтетической энионообмен-ной смолы, Амберлит tM-904, в сочетании со стабилизированным концентратом энзима также дали хорошие результаты при экспериментах по непрерыв25 ной переработке.

Описанная выше процедура в отно" шении носителя из регулируемой пористой окиси алюминия была повто-. рена с использованием стабилизироЗ0 ванного концентрата энзима по примеру 3. В табл.11 приводятся данные по влиянию энзимной нагрузки на непрерывную переработку (носитель из регулируемой простой окиси алюминия со"

35. держал 97-98» АЙ О, и 2-2,4 6 МоО с площадью поверхности 780 м /г).

Стабилизированный концентрат энзима эффективно сорбируется на носителе из регулируемой пористой окиси алюминия для обеспечения биокатализатора, который может быть использован для непрерывной переработки глюкозы в кукурузные патоки с высоким содержанием фруктозы. Высокие связующие эффективности и длительные полупериоды делают этот катализатор пригодным для использования в промышленном масштабе.

1024014

Продолжение табл.

0,05 (0,7r ) (0,07 мг) 3,6 (271 r) 15 ДЕ. Твердые вещества 2,0 (180 r), кукурузной патоки

ll»

0,05 (4,5 r) (1,3 мл) 3,6 (5,44 кг) 40 галлонов

3-я стадия (50-галлонный посевной чан) Крахмал, Код 3005

2,0 (3,04 кг)

0„O5 (75,75г) Пеноудалитель, НОДАС

200 (,Полипропиленгликоль) - (51 мл) «н»

3,6 (108,86 кг) -"4-я савелия (1000-галлонный йосевной бак

2,0 (60,33 к1 )

0,05 (1,497 -) (1 л) ° Е»» »Ев

Таблица 2

Содержание среды

Жидкость для замачивания кукурузы, Код Е801

4,0

Крахмал, Код 30005

2 ° 5

0,2

Ксилоза

1,0

2-я стадия (14-литровый лабораторный Фермента тор) Декстроза, Код 2001

Сульфат магния 7Н О

Пеноудалитель, НОДАС

200 (ПолипропиленI llHKOJlb) Жидкость для замочки кукурузы, Код Е801

Сульфат магния "7Н О

Пеноудалитель, НОДАС

200 (Полипропиленгликоль) Жидкость для замочки кукурузы, Код Е801

Сульфат магния <7НР

Жидкость для замочки кукурузы, Код Е801

Декстроза, Код 2001

Сульфат магния 78 .О

Пеноудалитель, НОДАС

200(Полипропиленгли-. коль), 2600,44.

1625,22

130,18

649,99

1024014

Продолжение табл, 2

Содержание среды

Вес кг тлицин

64,86

0,1

Нитрат аммония

130 18

0,2

Сульфат магния

32,66

0,05

Пеноудалитель, НОДАС 200 (Полипропиленгликоль) 20,82-22,71

Бикарбонат натрия

В м

Добавляется до стерилизации для доведения рН до $,8-6,0. Конечный объем

18000 галлонов (68137,4 л/. Рабочая температура 31 С.

Ф» ВО»» «»

Таблиаа 3

° Ф

Клеточная паста азат

Филъ трат

Едимичная активмоств, НЕИГ/r

ФФ

Объем, п

Вес,кг Едимичмал ак тивность, НЕИГ/r

Единичная ак тивность, НЕИГ/r

Вес, кг

1167.$ . 40.8 . 1123,2 42. .8

584,3 75,3

578.4

79.7

602,7 84,7 1124,8 . 47.3

658в1 89е9 1419 2 40 4

9 3220

10 3200

18,5

1105.8 42,4

587,9. 89,i

16,0

Ф ВФ ФФ ФФФФФ»ФФФФФ ФФФ разводка фермемтатора !

Загруз- Объем :Единичная ак ка,N и тивность, НЕИГ/r

6 3190 15,1

7 3065 18,8

8 . 3125 18,0

О» В» Ф Ф Ф ВФФ Ф,ВФФО ФФ» ° ФФФФФВ ВО»О ФООФФФ Непрерывное осаидение а»

Используют еилвтрувенд материал мдадкэладт-4200" а%И

Используют материал мдайкелайт Спидепоу".

1173,4 32,4

1362,6н 29,2

1627,6 24,6

1618,1""" 24.9

1727.d» i8.9

1024014 абли ца с

Показатели

6 7 8

9532,1 6680,6 8963,6

9089 3

8012,5

14,7

13,6

15,0

12 в3

21,8

25,61

21,4

24,7

28.0

Влажность (Карл Фиаер) Ф 61 9

66,2

59,4

60.9

64,8 49,4

61,0

59,9

13,6 35 5

Зольная окись, сухое вещество

13,5

13,4

37,6

3 3

3„7 31,6

4,6

9 7

11,6

3,8

18,6

3 3 673

0 77

0,14

0,48

0,28

0,125

0,068

0,023 0,1 1

0,023

12 5

18,8 17,0

1,80 8,1

2,33

2,10

16453 24649 12939

18278

60454,79

1270,7 х 10

21,0

9393,44 132,0

66,6 :, 17698,72.Изомераэиая активность, ИЕИГ/г сухое вещество

Удельная активность, ИЕИГ/r, протеин

Сухое вещество, Ф

Протеин(Кьельдаль),Ъ, сухое вещество

Нерастворимое сухов! вещество, 3 на сухое вещество

Ид, мг/мл

Mg4+, молярный

Mg +/ïðîòåèí, соотношение 2"Пропанол,Ф (по разнице) ФосФор, Ф, сухое вещество

Конечный вес извлеченного стабилизированного концентрата энзима,ч, сухое вещество

Вся ферментационная разводка

Клеточная паста

Сырой лизат

Загрузка,М

«»«»»ее»»«»ее»ее

9 (10

»»ю»»»» ««««Й««

Таблица 5

1240,0 х 10

1178,9 х 10

1024014

Продолжение табл, 5

Осветленный лизат

875,7 х 10

16200,51

54,0

Стабилизированный концентрат энзима

1М-М

892,8 х 10

11654

287,58

° «

Представляет величины, полученные по разнице или оценочные.

Величина дается на сухое вещество.

Общая активность осветленного лизата определялась оценкой веса осветленного

ИН лизата и измерением изомеразной активности в нем; Очевидно, что действительный общий вес выше, чем оценочная величина, так как количество изJ влеченного стабилизированного концентрата энзима было больше, чем определенное для осветленного лизата.

Таблнща 6

«!ф «

3arpys ка, It в течение, нес

I .10!62

10 6

46 40

2 10289,8

3 3910,7 94 !00 1О1

2441 47 1 00 105 102

5 5823 7 96 103 !07

80 81 76 60 80 . 39 28 б

88 89

82 64 80 6! 0

91 86 90 66 3 1

6 7960,9 95 )00 105 - 99 !00 91 98 97 44

7 922&э57 95 100 107 - 98 97 89 96 101 62 23 21

8 10215,59 101 93 82 85 88 82 83 88 78 5 3

9 7504,6 100 95

88 89 82 63 84 69 5.

86 87 8l 86 86 80 58 48 42, 96 90.

10 9113 36 90

11 11654,0 88

Среднее 96

85 90 - 83 8& - 33 26!!

Это первоначальная величина анализа в начале этого исследования на стабильность но не первоначальная величина анализа на основе последующих приготовлении энзина, q чен указывалосв в предыдущих примерах.

Начальная актиеност

НЕНГ/r сухое в щество

Йервоначальнал изонеразная активность, 2 лри хранении лр» тенлвратуре, аС с

«е е е «ем е

18 26 37

l0I 10! 105 - 97 98 92 96 96 43

100 102 105 - 103 107 96 103 106 77

99 100 86 92 90 86 90 85 34 17 13

3 024014

Таблица 7

Светопропускание, .3, нм Активность во вс лываюнцем слое, ИЕИГ/мл

260 280 рН

Соль

Вес соли, г

КонтPollb H6 я

139 65

1 53 1 06 6 40

2 79

1,0

3е33

1,55 1 08 6138

3 14 йаСт

2,0

2 76

1,82 3 3 0 63 5

3,50 1 03: 6,45 йаС 2

5 09

Mg5О»

2,87

0,25

1,48 0,995 6,45

3 65 3,12 6>30

3,68 1,33 6,25

2,36

0 50,Ид5О

3,17

3 O

Hg 50, 2,0

0,20

Mg5o4

° »»»»»»

Величина рН в этих испытаниях относительно низкая, что можно отнести за счет низкой изомеразной активности. Однако недостаточно низкая, чтобы отнести ее за счет почти полной потери изомеразной активности во всплывающем слое при 2,0-граммовом уровне суль®эта магния. 33олагается, что увеличение температуры до 35-40 С после второго добавления лизоцима было в значительной части при иной дезактивации энзимйой активности в этом эксперименте.

Т а б л и ц в 8

Ф по объему добавленной !И соли

Извлеченный энзим

Соли

Соли магния

97 100 100 95

Удельная ак" тивность+" 2,4 - 15,7

И 50 3. ) 7И О

35,8 33,6 11,0

103 3 03 105

MgC3

15 100

Удельная активность

Ия(С НЭОг3

16,4 36,9

15,6

9.5 15,4

Одновалентные катионные силн

Na 504

Удельная активность.2,6 8,4

43 44

1024014

Продолжение табл. 8

Извлеченный энзим

4. по объему добавленной 1И соли

5 10

Соли

« (НН4,) SO<

Удельная .активность

2,6 2,9

1 1

0 йаС К

Удельная активность

1,8 1,9

ВаС К

Удельная активность

8,4

8,8

11,9

104

Удельная активность

14,3

12,7

Сас22

Удельная активность

8,9

6,2

7,9

CoC) Удельная активность

0,8

5,6

9,1

ИпСК2

Удельная активность

2,8.2,6

3,9

««

0,025;. 0,045; 0,08

««

+Соответствующие молярные концентрации суть 0,01; . и 0,14.

ММ

Протеин при удельной активности, определенной по .при 280/260 нм и указанной в ИЕИГ/мг протеина. светоиспусканию

Т а б л и ц а 9

Носитель

Связующая способность

Носитель

Анионо-обменная смола

ИЕИГ/г сухое вещество

Использованная изомераза и .152

SEC . 333

Буфер ""

Прочие двухвалентные катионные соли

Амберлит IRA-938

Предварительная обработка

Буфер Зсмк

Продолжение табл. 9

1024014

Носитель

Связующая способность

ИЕИГ/r сухое вещество.Носитель

««»»»«»««» «««»» »««»«а«»» ° .«»«»

Использованная изомераза

Предварительная обработ ка

Анионо-обменная смола

«»»«» ю

Буфер "+

Буфер

113

SEC

Селектацель"Тип 20

851.Селектацель-Тип 20

Селектацель"Тип 20

1487

SEC

936

М и - нормальная растворимая изомераза глюкозы

Буферный рас-вор, содержащий 0,05 И (рН 7,7) буфер из фосфата калия, 0,01 И Ио504 НеО и 0,000I И Со/С1 6НдО °

Таблица 10

° ° °

««

Полурас"

Рад. (сут/

Система непрерывндй переработки

Средняя нагрузка мИ ИЕИГ/фут

Зффективность

Сухое вещество при 2"х полулиниях, ИЕИГ/r

- Пористая окись алю" мимия с регулируемым .размером пор

0,09

0,61 48

Основной карбонат магния

1,95

0,29 36

0,26

ДЗАЭ-целлюлоза/селектацель-200

051 12

0,42

0,22 5,6

0,49 31,0

1 13 4 3

2,12

0,15

0,54

1 92

0,38

0,49 14

Клетки "Сил-флоу".

Ия (ОН), 0,44 17 . 0,36

2,21

Пористую окись алюминия помещают в колонку 3,0х18 см с рубашкой, заполненной сначала 3 мм стеклянных шариков, накрывают сеткой с мелкими отверстиями, частично заполняют 0,1 И раствором ацетата магния, добавляют 55,6 г носителя, после чего. колонку подвергают обратной промывке

: 0,1 И ацетата магния для флюидизации слоя. Сетку с мелкими отверстиями помещают на носителе и покрывают сверху стеклянными шариками. Затем в колонку подают 40000-46000 ИЕИГ стабилизированного концентрата знзима и колонку промывают раствором ацетата магния.

Амберлит I RA-93

Амберлит IRA-93

ДЗАЭ-целлюлоза

"" Дпрко S-51 Углерод

Амберлит IRA-904

Амберлит. IRA-937

Клетки "Сил-Флоу", (без Мд(ОН) ) ИдSO

Буфер

И9504

8 91

° 0,16

6,45