Способ получения иммобилизованной глюкозоизомеразы

 

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИМГЮБИЛИЗОВАННОЙ ГЛЮКОЗОНЗОМВРАЗЫ, включающий обработку клеточного концентрата - культуральной жидкости BacMtus coagulans, предварительно сконцентрированной до содержания сухого вещества 3-30 вес.%: и подвергнутой гомогенизаций до раэруше ния 25-100% содержаиихся в ней клеток раствором глутарового альдегида , в количестве 0,01-1 вес.ч. на 1 вес.ч. сухого вещества в клеточном концентрате, вьщерживание полученной смеси до образования геля и удаление из геля избыточной влаги, отличающийся тем, что, с целью активирования и стабилизации фермента, в полученный продукт вводят 0,1-0,5 вес.% водорастворимой соли железа в твердом виде и 1 вес.% окиси магния в расчете на сухое вещество обезвоженного геля с последующей экструзией и сушкой экструдата в псевдоожижен 1ом слое, 2. Способ по п. 1, отличающийся теп, что в качестве сл соли железа.используют сульфат железа (III) или аммонийцитрат железа Ш .) , или цитрат келеза

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

3 (19) (11) 3(51) С 1 2 и 9 9 2 С 1 2 И 1 1 0 0

f

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н ГЗАТЕНТМ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ГЮ ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ-И ОТКРЫТИЙ (21) 2650551/28-13 (222 22.08.73 (31) 827030 (322 23.08.77 (33) США <46) 07,07.83. Бюл. В 25 (72) Таге Кьер Нильсен, Лена Элизабет

Зиттан (.Дания), Вильям Карасик (CIHA) и Кейт Джибсон (Дания 2 (712. Ново Индустри А/С (Дания) (53) 577 ° 15.07 (088.8) (56) 1. Патент СШЛ Р 3788945, кл. 195-31 F, 1974.

2. Патент 0))А Р 39805216, кл. 195-68, 1976. (54) (572 1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММОБИЛИЗОВАПНОЙ ГЛЮКОЗОИЗОИЕРАЗЫ, включающий обработку клеточного концентрата — культуральной жидкости

Bacillus coagulans,.ïðåäâàðè åëüíî сконцентрированйой до содержания сухого вещества 3-30 вес.В: и подвергнутой гомогенизации до разрутаее ния 25-100"-.8 содержащихся в ней клеток раствором глутарового альдегида, в количестве 0,01-1 вес.ч. на

1 вес.ч. сухого вещества в клеточном концентрате, выдерживание полученной смеси до образования геля и удаление из геля избыточной влаги, отличающийся тем, что., с целью активирования и стабилизации фермента, в полученный продукт вводят 0,1-0,5 вес.Ъ водорастворимой соли железа в твердом виде и

1 вес.Ъ окиси магния в расчете на сухое вещество обезвоженного геля с последующей экструзией н сущкой экструдата в псевдоожиженном слое, 2. Способ по и. 1, о т л и ч а ю шийся тем, что в качестве соли железа используют сульфат железа (III) или аммонийцитрат же леза(111), или цитрат железа (III), или пирофосфат железа (111), или сульфат железа (112, или лактат железа YI).

1028251

Изобретение относится к способам получения иммобилизованной глюкозоиэомеразы и может найти применение для получения активных и достаточно стабильных препаратов глюкозоизомераэы, используемой для конверсии глюкозы во фруктозу.

Известен ряд способов получения иммобилизованной глюкозоизомеразы, связанной с носителями как неорганической природы, так и органической (ионообменные синтетические смолы и производные целлюлозы).

Однако для известных способов характерна недостаточная стабиль.ность получаемых продуктов, а также 15 необходимость добавления ионов кобальта и магния во фруктозный сироп перед конверсией для активирования фермента и последующая ионообменная очистка целевого продукта. 20

Известен также способ получения иммобилизованной глюкозоизомеразы путем связывания фермента с диэтиламиноэтилцеллюлозой (1 ).

Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности является способ получения иммобилизованной глюкоэоиэомеразы, включающий обработку клеточного концентрата - культуральной жидкости Bacillus coagulans, предварительно сконцентрированной до содержания сухого вецества

3-30 вес.Ъ и подвергнутой гомогенизации до разрушения 25-100% содержащихся в ней клеток раствором глутарового альдегида в колйчестве

0,01-1 вес.ч. на 1 вес.ч. сухого вещества в клеточном концентрате, выдерживание полученной смеси до образования геля и удаление из геля избыточной влаги с последующей эаморозкой и измельчением продукта $2j.

Недостатком известного способа является невысокая активность и падение ее в процессе эксплуатации 45 ферментного препарата.

Целью изобретения является повышение стабильности и активизаций иммобилизованной глюкозоизомеразы. укаэанная цель достигается способом получения иммобилизованной глюкозоизомеразы, заключающимся в обработке клеточного концентрата— культуральной жидкости Bacillus

coagulans, предварительно сконцентрированной до содержания сухого вещест-. ва 3-30 вес.Ъ и подвергнутой гомогеиизации до разрушения 25-100% содержащихся в ней клеток раствором: глутарового альдегида в количестве

0,01-1 вес.ч. на 1 вес.ч. сухого б0 вещества в клеточном концентрате, выдерживании полученной смеси до образования геля, удалении из геля избыточной влаги, причем Bïoëó÷åíííé обеэвоженный гель вводят 0,1-0,5 вес.3 5

Ь водорастворимой соли железа в твердом виде и 1 вес.Ъ окиси, магния в расчете на сухое вещество обезвоженного геля с последующей экструзией и сушкой экструдата в псевдоожиженном слое.

В качестве соли железа используют сульфат железа (III) или аммонийцитрат железа IXI), или цитрат железа (;117), или пирофосфат железа ХТХ), или сульфат железа (7I) или лактат железа (Х1) .

Для активизации и стабилизации иммобилизованной глюкоэоизомераэы в процессах конверсии глюкозы нецелесообразно соль железа вводить в глюкозный сироп, что требует дополнительного контроля за работой дозаторов, поскольку способностю энзима связывать железо либо незначительна, либо очень ограничена, точка насыщения достигается в течение длительного периода процесса изомеризации. В любом случае утечка железа в продуктовый поток может происходить в любой точке процесса.

Присутствие железа в продукте вызывает окраску в такой степени, что требуется,его очистка, например, ионообменом, что удорожает стоимость очистки.

Пре::араты клеточной массы изомеразы глюкозы могут связывать значительные количества железа, причем сравнительно небольшое количество железа теряется при длительном контакте с.глюкозой и глюкозофруктозным сиропом. Количество железа, вводимого в препараты клеточной массы, соответствует необходимому для активации и стабилизации фермента количеству. (Термин "клеточная масса", "препарат клеточной массы" и "порошок клеточной массы" применяются для определения формы, препарата и частиц, получаемых, фор. муемых или изготовленных из вещества клеток микроорганизмов вместе с органическими реагентами, например глутарельдегидом, протеиновыми и агломеризующими агентами, например полиэлектролитами).

Кроме того, улучшение производительности и/или стойкости глюкозоизомеразы может происходить если другие твердые ингредиенты также подмешиваются к энзимному препарату, Начальное падение рН, происходящее в течение 1-2 дн после загрузки колонки свежим препаратом, вызывает ряд трудностей.

Уменьшение рН в колонке нежелательно, поскольку оно вызывает сокращение активного энзимного слоя, т.е. падение активности.

Введение 1Ъ по весу окиси магния на сухое вещество изомеразы глюкозы

1028251

50 в препарат клеточной массы способствует преодолению начального падения рН в значительной степени, таким образом получают сравнительно стойкие величины рН сиропа. Кроме того, можно добавлять твердую глюкозу (моногидрат глюкозы), которая служит разбавительной добавкой препарата клеточной массы, в количестве 2-15% по весу сухого вещества.

Водорастворимую соль железа смеши- 10 вают с окисью магния и глюкозой, а затем добавляют к клеточной массе перед экструзией, которая дает го.товый гранулят.

Активность. Единица активности 15 представляет собой количество энзима, которое образует фруктозу при начально л расходе - 1 мкмоль фруктозы. в минуту при данном наборе усл<>вйй изомеризации. 20

Анализ активности. Активность определяют при следующих условиях: сироп - 40% по весу растворенной . декстрозы, рН на входе 8,5;

М9++ 0,004 Ы, температура 65 С, диаметр колонки 2,5 см, высота ко:.лонки 35 см. Направление потока .сверху вниз. Активность выражают .в единицах 1 Q1C/1 г вещества.

Производительность. Производительность дается в кг декстрозы (сухое вещество), превращенной в смесь

45%. фруктозы и 55% глюкозы на 1 кг внзима, через определенное время изомеризации. В примерах производительность рассчитана по указанному 35 уравнению после времечки изомеризации 2у Т>д

Железо. Содержание железа определяется по о -фенантролиновому методу, Окраска. Окраску определяют по методу C1RF.

Стойкость окраски. Стойкость окраски определяют через 1 ч при 100 С при рН 4,2 (C1R F). Используют.

Окись магния тяжелОГО типа ER/Â 45

Фирмы Фармелко, Милан, Италия., Пример 1. Добавленйе цитрата железа (ТИ), лактата железа (II) и сульфата железа (ТТЦ в сочетании с NqO и декстрозой.

Добавление окиси железа (1ТТ).

1550 л культурального бульона после Ферментации изомеразы глюкозы, вырабатываемой Вас. coagui ans, концентрируют путем центрифугирования при 10 С до получения Отстоя, содержащего около 12 г сухого веса (105+C),: на 100 мл концентрата.

12 r образовавшегося отстоя гомогениэируют с целью освобождения энзима путем распада клеток. При 60 рН около 7,5 его откачивают через гомогенизатор.

Падение давления составляет

300-350 кг/см 2; Гомогенат практичес-. ки целико л активный в растворимой 65 форме подвергают флокулированию с помощью 30 мл/л 50%-ного раствора

Дрюорлок ЕС25, а затем реакции с

40 мл/л раствора 50%-ного глутарового альдегида для получения концентрации около 2% глютарового альдегида в растворе. После реакции в те чение 1 ч образовавшийся гель измельчают механическим способом, разводят в 20 л обессоленной воды и фильтруют. Осадок из фильтра продувают сжатым воздухом с целью удаления свободной воды. Осадок гранулируют на качающемся грануляторе, снабженном сеткой с отверстиями

1 см. Грубый гранулят содержит 75% воды (определяют сушкой при 105 C).

Гранулят делят на партии:

A. 8,5 кг грубого гранулята экструдируют осевым экструдером, снабженным сеткой с отверстиями

0,8 мм. Экструдат сушат в кипящем о слое воздухом при 60-65 С до влажности 10%.

В. К 8,5 кг грубого гранулирован. ного осадка добавляют смесь 20 r

Mq0, 85 r моногидрата декстрозы и 40 г цитрата железа (III) и с содержанием Fe 16%. После тщательного смешения смесь экструдируют и сушат как в партии A. Содержание

NgO 0,98%, железа 0,31%.

С ° 8,5 кг грубого гранулята смешивают со смесью 20 г М90, 85 г моногидрата декстрозы и 30 г сульфата ><елеза (III) с содержанием железа 20%. После тщательного перемешивания,смесь экструдируют и сушат как в партии A. Содержание Mg0 0,98%> железа 0,37%.

Д. 8,5 кг грубого гранулята с1лешивают со смесью 20 r Ng0, 85 r моногидрата декстрозы и 30 r сульфата железа (III) с содержанием железа 20%. После тщательного перемешивания смесь экструдируют и сушат как в партии A. Содержание NgO 0,98%, железа 0,29%.

Полученные препараты просеивают до 0,35 - 1 мм и анализируют; Величину рН определяют в выходящем сиропе в пробах, отобранных через

20 и 43 ч, соответственно. Перед определением рН пробы охла>хдают до

25 С. Результаты приведены в табл. 1.

Пример 2. Добавление цитрата железа (1ТХ), пирофосфата железа, (III) ам<лонийцитрата ><елеза (ТИ) и сульфата железа (ХТ .

Грубогранулированный осадок с фильтра с 76% воды, как в примере 1, .разделяют на шесть партий по 8,5 кг.

A. 8,5 кг осадка экструдируют и сушат как в примере 1 и получают эталонную композицию.

В. К 8,5 кг грубого гранулята добавляют смесь 25 кг Ngo, 25 г цитра:та железа с 16% железа и 250 .г

1028251 моногидрата декстроэы. После переме- . шивания гранулят экструдируют и сушат как в партии A. Содер>хание NgO 1,23Ъ, железа 0,20Ъ.

С. 8,5 кг гранулята экструдируют и сушат как в партии A после добавления 25 г И<>0, 50 r цитрата железа (III) и 250 г моногидрата декстрозы. Содержание NgO 1,23Ъ, х<елеэа

0,40Ъ.

D. 8,5 кг грубого гранулята об- 10 рабатывают как в партии С, но 50 г цитрата железа (ИХ) заменяют 30 г пирофосфата железа (III) с 12Ъ железа. Содержание Hg0 1,23Ъ, железа

0,18Ъ. 15

E. К 8,5 кг грубого гранулята добавляют 25 г И90, 0,250 г моногидрата декстрозы и 30 r аммонийцитрата железа (III) с 15Ъ железа. После перемешивания гранулят экструдируют и сушат как в партии A. Содержание

Hg0 1,23Ъ, >хелеэа 0,22Ъ.

F, К последней партии в 8,5 кг добавляют 26 г И90, 250 г моногидрата декстрозы и 30 г сульфата железа (11) и ЗОЪ железа. После тщательного перемешивания гранулят экструдируют и сушат в партии A.

Содержание И90 1,23Ъ, >хелеза 0,44Ъ.

Высушенные препараты просеивают . до размера 0,35-1 мм и анализируют, рН выходящего сиропа определяют через 20 и 43 ч.

Результаты приведены в табл. 2

Заметной разницы в активизации использованными солями железа не 35 отмечается.

Пример 3. Опыты по изомеризации.

Для следующих препаратов применяют грубый гранулированный осадок 40 с фильтра в соответствии с примером 1.

В осадке на фильтре содержится

77Ъ.води. 410/A нет добавления.

410/В: 2 ч. по весу смеси добав- 45 ляют к, 98 ч. по весу сухого осадка. Смесь содерх<ит 100 ч. декст-; роэи, 10 ч. HgO и 12 ч. сульфата железа ХХХ). 410/С: 7 ч по весу смеси добавляют к 93 ч..по весу сухого осадка на фильтре.

Затем смеси 410/A-410/С экструдируют через сито с отверстием ,0,8 мм, сушат в кипящем слое до остаточной влажности 10Ъ. Определяют содержание железа в готовых препа, ратах: 410/A 0,04Ъ, 410В 0,08Ъ, 410/C 0,18Ъ. Изомеризацию ведут с веществами из препаратов 410/А, 410/В.и 410/C при следующих услови- 60 яхг сироп 45Ъ по весу растворенной декстрозы, РН на входе 8,4+0,1, размер колонки h 40 см; d 5,8 см, Ид++ 0,0016 М, объем 1 л, температура 62 С, вес энзима 260 r.

Энзим вымачивают 2 ч при комнатной температуре в указанном сиропе, но при рН 8,0, затем помецают в колонку. Получают. резулътаты, приведенные в табл. 3.

Определяют концентрацию железа в выходящем из этих колонок сиропе.

Результаты приведены в табл. 4.

Второй комплект опытов йо изомеризации проводят с веществами из препаратов .420/В, 410/С и 410/A при следующих условиях: сироп - 45Ъ по весу растворенной декстрозы, рН на входе 8,4 0,1, ИО+ф 0,0016 И; температура 65оС, размер колонки

h 20 см; d 2,5 см, объем 100 мл, вес энзйма 20 . г. Энзим вымачивают

1 ч при комнатной температуре в указанном сиропе, затем загруйают в колонку. Получают данные, приве- . денные в табл. 5.

Определяют концентрацию железа в выходяцем из этих колонок сиропе.)

Результаты приведены в табл. 6.

Определяют краску по С1Р Г выходящего сиропа. Результаты приведены в табл. 7.

Для определения сравнительная окраска по C1R F для трех входящих сиропов эа этот период составляет

0,019, 0,012 и 0,014 °

Определяют стойкость окраски выходящего из трех колонок сиропа.

Результаты приведены в табл. 8.

Для сравнения определяют стойкость окраски входящих сиропов за этот период, которая равна 0,004, 0,002 и 0,004.

Содержание железа э энзимном препарате определяют.до и после его использования. Результаты приведены, в табл. 9.

Пз табл. 9 видно, что содер>хание х<елеза через 900 ч больше, чем в начале опыта, что объясняется поглощением х<елеза знзимом из поступающего сиропа. Поскольку в сироп не

Добавляют ><елеза в этих опытах, оно образуется эа счет следов железа, присутствующего в растворе кристаллической декстроэы. Анализ 45Ъ-ного по весу декстрозного сиропа на ><елезо показал, что его количество составляет <.0,5 ч/мин, около

0,1 ч./млн. В течение 900 ч работы этих колонок через каждую из них, содер>хащую по 20 г энзима, проходит

75000 r сиропа. Если средняя концентрация 0,1 ч./млн, то обцая концентрация железа в сиропе 75000- 10->г =

7,5 r. Это соответствует количеству железа, задержанному энзимом за время опыта.

Добавление соли железа повышает активность без ухудшения стойкости и повы<аает производительность на

20-30Ъ. Добавление меньших количеств, 1028251

Таблица 1

Активность

16 1С/г

Прирост, В

Препарат

6,68

7,62

246

307

8,20

7,99

В

7,98

7,60

296

8,14

7,90

308

Сравнительный.

Таблица 2

Активность Прирост, Ъ

1 61С/г

Препарат

А"

6,64

7,25

229

7,90

8,24

261

7,84

8,22

273

7,79

7,70

8,19

266

8,14

8,03

7,87

263

И90 и соли железа, как в 410/В, дает меньшее увелйчение рН на выходе и производительности, но и эти увеличения значительйы.. Пример 4. Сравнение двух- и трехвалентного железа.

К пробам грубо гранулированного

Осадка на фильтре, полученного согласно примеру 1, добавляют. смесь соли железа, декстрозы и Ng0. 3атем смесь экструдируют через сетку с отверстиями 0,8 мм и сушат в кипящем слое до влажнОсти 10%. Состав и количество смеси соли железа, декстрозы и И90 указаны в табл. 10 °

Анализ препаратов дал следуюшие содержание железа: 1 g 403 11С

0,22% 1 G 403 .11D 0,27%. Условия изомеризации: сироп — 45% по весу растворенной декстрозы," рН на выходе 8,4 + 0,1, kg+ 0,0016 И, темпе8 ратура 65 С, вес энзима 20 r, размер колонки h 20 см, d 2,5, V 100 мм.

Энзим вымачивают 1, ч при комнатной температуре в этом сиропе и загружают в колонку., Результаты приведены в табл. 11.

Содержание железа в энзимном препарате определяют до и после примене10 ния..Результаты приведены в табл. 12.

В течение опыта содержание железа несколько увеличивается, что указывает на сорбцию железа препаратами из следов железа в сиропе

15 декстрозы.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет получать активированную и стабильную в процессе использования иммобилизованную глюкозоизомеразу.

1028251

Активность °

16 1С/г

Таблица 3

Препарат

Время полураспада

Т,, ч

Общее время опыта, ч

1880

6,9 6,8 7,2 842

1293

158

410/А

2295

7,3 7,5 7,7 843

1316

202

410/С.Таблица 4 та

Препарат

Таблица 5

Препарат

Полураспад T ч

Производи. тельность через

2 Т (а

7,8

900

7,0

8,1

512

1510

484

900

7,Б

8,0

8,2

6,9

7 4

8,2

900, 485

Та блица 6

Препарат

0,8

С 0,5 (0,5

410/B

С0,5

3,6

С0,5

410/С с0,5

<0i5 (0,5

410/A

410/A

410/С (approx)

Актив- Общая ность, длитель16 1С/г ность опыта, 410/В 210

410/С 250

410/A 190

<0,5 (0 5 (0,5 (0,5

С0,5

<0,5

Производительность через

2МТ (, ч

1 340

1028251

Таблица 7

Препарат

0,232,Таблица 8

Стойкость окраски сиропа, после начала:.опыта через

Препарат .

О ч (вымачивание) 24 ч

72 ч

0,040

0,21

0,050

0,21

0,044

0,22

Табли а 9

"r ц

Количество железа в колонке, содержащей 20 q энзима, мг

Препарат

Через 900 ч

В начале опыта

14

410/A Таблица 10

1 !

Препарат Соль железа Декстроза,% Окись магния,% 16 403 11С 1,2% сульфата железа (III) .1 5 403 11D 1,2% сульфата железа (Т1) Таблица 11

Активность Общая дли- . Полураспад Производитель1 61С/г тельность Т,, ч ность 2 Х Т, ч опыта, ч

Препарат

755 482

2093

1 Я 403 11 С 290

1 Q 403 11 О 274.: .467.:

755

1914

410/В .410/С

410/B

410/С

410/А

410/В

410/с

410/A

0,266 .0,247 о,озо

О,ОЗ6

0,036

0,019

0,020

0,022

0,014

0,017

0,017

1028251

Таблица 12

Препарат

0 ч.52

68

Редактор Н. Рогулич

Заказ 4769/61

1 О 403 11 С

1 G 403 11 0

Количество железа в колонке с 20 r знзима, мг, через

Составитель О. Скородумова

Техред М. Гер гель Корректор С.В1екмар

Тираж 523 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская иаб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4