Способ получения глюкозоизомеразы

 

ОП ИСАНИЕ

Н3О6РЕТЕ Н ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советских

Социалистических

Республик (i i) 977491 (61) Дополнительное к авт. свид-ву— (22) Заявлено 22.06.81 (21) 3307211/28-13 с присоединением заявки №вЂ” (51) М, Кл. з

С 12 N 9/22

Гасударственные камнтет (23) Приоритет—

СССР (53) УДК 557.! 5 (088.8) Опубликовано 30.11.82. Бюллетень № 44

Дата опубликования описания 05.12.82 по делам изобретений и вткрмткй

А. В. Гавристов, В. П. Афанасьева, Н. С. Головина и Л А. Нахапетян

Г (72) Авторы изобретения

Московский ордена Трудового Красного Знамени институтпии(евой,- промышленности и Всесоюзный научно-исследовательскии биотехнический институт (71) Заявители (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЛЮКОЗОИЗОМЕРАЗЫ

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к получению ферментных препаратов, и может быть использовано в крахмало-паточной и гидролизной промышленностях для получения фруктозосодержащих сиропов из глюкозы, полученной путем гидролиза крахмало- или целлюлозосодержащего сырья.

Известен способ получения глюкозоизомеразы путем культивирования микроорганизмов рода Streptomyces на питательных средах, содержащих в качестве активатора биосинтеза фермента глицин и нитрат аммония (по 05%) (1).

Недостатками способа являются невысокий уровень продуктивности биомассы по 1s глюкозоизомеразе, а также использование дорогостоящего реактива — глицина, что значительно увеличивает стоимость получаемых препаратов глюкозоизомеразы.

Также известен способ получения глюкозоизомеразы, предусматривающий культивирование микроорганизмов рода Streptomyces на питательных средах, содержащих источники углерода, азота, минеральные соли и индуктор биосинтеза глюкозоизомеразы, при температуре 30 С и перемешивании с последующим отделением биомассы, где в качестве индуктора используют Д-сорбит в концентрации 1,0 вес.% (2).

Основным недостатком прототипа является недостаточная эффективность Д-сорбита, используемого в качестве вещества, активирующего биосинтез глюкозоизомеразы, так как он увеличивает продуктивность культуры по глюкозоизомеразе только на

10 — 15%, что является недостаточно высоким показателем. Кроме этого, концентрация вносимого в среду активатора достаточно высока, что приводит к удорожанию питательной среды, а значит, и получаемого препарата глюкозоизомеразы.

Цель изобретения — увеличение продуктивности микроорганизмов по глюкозоизомеразе.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения глюкозоизомеразы, предусматривающему культивирование микроорганизмов рода Streptomyces на питательных средах, содержащих источники углерода, азота, минеральные соли

977491 и индуктор биосинтеза глюкозоизомеразы, при температуре 30 и перемешивании с последуюшим отделением биомассы, в качестве индуктора используют Д-ксилит в концентрации 0,01 — 1,0/p от среды.

Изобретение поясняется примерами.

Пример 1. Культуру Streptomyces aibogriseoIus 28 — 3 (ВКМ А-588) выращивали в колбах емкостью 700 мл, содержащих по

35 мл питательной среды следующего состава, /p. Д-ксилоза 1,0; пептон 1,0; дрожжевой экстракт 1,0; К НРО 0 3; +SO ; 7;

H О 0 1; агар-агар 0,1. Исходный рН питательной среды до стерилизации 7,2. Продолжительность стерилизации 30 мин при

0,5 ати. Засев проводят споровой суспензией, полученной путем смыва воздушного мицелия стерильной водой с культуры, выращенной на скошенной агаризованной среде. Культивирование ведут на круговой качалке при п = 200 об/мин, 30 в течение

40 ч. Выращенный инокулят используют для засева колб емкостью 750 мл, содержащих по 50 мл среды вышеописанного состава, в которую вместо Д-ксилозы вносили Дксилит или Д-сорбит в концентрации 1,0 вес. /р. Доза засева составляет 10 об. /p.

Исходный рН сред до стерилизации 7,2. Продолжительность стерилизации 30 мин при

0,5 ати. Культивирование вели в течение

24 ч на круговой качалке при и = 200 об/мин, 30 . После окончания культивирования вырагценную культуру центрифугировали в течение 15 мин при 5000 об/мин (центрифуга

ЦЛС-ЗМ). B полученном супернатанте определяли значение рН, а осадок дважды промывали дистиллированной водой для удаления остатков питательной среды. Промытую биомассу используют для определения глюкозоизомеразной активности. Для этого готовят изомеразационную смесь следующего состава: Д-фруктоза 2 О М; MgSO4X

X 7Н О 5.10З М, фосфатный буфер рН7,0

0,05 M. К 5 мл изомеризационной смеси, термостатированной при 70 в водяной бане, добавляют примерно 100 мг влажной биомассы продуцента. Полученную суспензию термостатируют при постоянном перемешивании в течение 30 мин при 70, после чего колбочку с суспензией охлаждают в ледяной бане для остановки реакции изомеризации. Количество образовавшейся

Д-глюкозы определяют автоматически на глюкозном анализаторе фирмы «Beckman».

За единицу активности (МГлИЕ) принимают количество фермента, необходимого для получения 1 мм Д-глюкозы из Д-фруктозы в минуту при 70 и описанных выше условиях изомеризации. Расчет продуктивности штамма по глюкозоизомеразе ведут, подсчитывая количество МГлИЕ, полученных с литра питательной среды.

15 го

Результаты определения активности глюкозоизомеразы и продуктивности культуры, полученные после культивирования штамма

Streptomyces aIbogriseolus 28 — 3 на питательной среде, содержащей Д-ксилит, в сравнении с другими углеводами приведены в табл. 1. Из данных табл. 1 следует, что добавление в питательную среду Д-сорбита приводит к увеличению продуктивности культуры по глюкозоизомеразе - на 13 /р, а внесение jI,-ксилита в той же концентрации увеличивает продуктивность культуры по глюкозоизомеразе на 65 /р.

Пример 2. Получение биомассы и определение активности глюкозоизомеразы проводят так, как это описано в примере l.

На стадии ферментации используют питательные среды, составы которых приведены в табл. 2. Исходный рН сред № 1 — 4 до стерилизации составляет 7,0, а среды № 5 6,2. Результаты определения продуктивности мицелия, полученного при культивировании на этих средах в присутствии

0,1 вес. /р Д-ксилита и без него, представлены также в табл. 2. Как можно видеть, внесение Д-ксилита даже в концентрации

0,1 вес. /р оказывает значительное стимулируюшее влияние на биосинтез глюкозоизомеразы. Продуктивность культуры по глюкозоизомеразе увеличивается в зависимости от состава питательной среды в

2 10 раз.

Пример 3. Получение биомассы и определение актиьности проводят так, как это описано в примере 1. На стадии ферментации используют питательные среды № 1 — 5 (табл. 2, пример 2), в которые вносят Дксилит в концентрациях от 0,01 до 0,2 — 0,3 вес. /p. Результаты определения продуктивности мицелия по глюкозоизомеразе представлены в табл. 3.

Анализ результатов позволяет сделать вывод о том, что насышаюшей концентрацией Д-ксилита является концентрация 0,1—

0,2 вес.Р/р. Снижение концентрации Д-ксилита ниже О,OIP/р не выгодно из-за незначительности оказываемого стимулирующего эффекта, увеличение же концентрации Дксилита выше 1,0 вес.Р/p невыгодно из-за возрастания стоимости питательной среды без соответственного увеличения стимулирующего эффекта.

Применение предлагаемого способа получения глюкозоизомеразы позволяет в

2 — 10 раз увеличить продуктивность биосинтеза глюкозоизомеразы. Кроме того, ввиду невысокой стоимости Д-ксилита (2 руб/кг) и малой концентрацией его в питательной среде себестоимость единицы активности глюкозоизомеразы остается прежней или снижается.

977491

Таблица 1

Продуктивность культуры продуцента на средах с различными углеводами-индукторами

Углевод

Концентрация, вес. /

Биомасса, г влажной биом./л

Активность глюкозоизомеразы

ИГлИЕ/л пит. среды у от контроля пит. среды

Д-ксилоза (контроль) 234,6 1555

135,0 1657

140,0 256?

1,0

100

Д-сорбит

Д- ксилит

1,0

113

165

1,0

Таблица 2

Кор- СахаПактоза

КисМочевина

КисМеБио- рН масса кон.

МАМБО

7 Н О

Д-ксиК HPO

Активность глюкозоизомеразы

Среда ласроза потный лоти ый са лит вые дрожг идгидролиролизат жи зат овсяной кормошелувых дрожжей хи

1 по с.в. по

МглИЕ/л пит среды г влажчой биом/л по

PB с.в. пит. среды

О 22 1,О 1,0

О 22 1,О 1,0

0.3 0,1

207 7,73

208 7,61

227 7,45

258 7,43

201 7,79

199 7,77

223 7,51

207 7,60

254 7,31

245 7,24

315

3146

0,3 О, 1 0,1

0,22 1,0

0,22 1,О

282

1,0 0,3 0,1

1,О 0,3 0,1 0,1

1876

437

0,22 1,0

0,22 1,0

0,3 0,1

2457

О ° 3 0,1 О,1

0,22 1,0

0,22 1,0

2,0

0,3 0,1

257

2,0

0,3 0,1

0,1

2523 зава

1,0 0,22

1,0 0,22

5 2,5

0.3 0,1

0,3 О,1

2,5

6792

0,1

Продуктивность биомассы и синтез Фермента при культивировании на средах различного состава с внесением и без внесения Д-силиката

977491

Таблица 3

Влияние Д-ксилита в концентрации 0,01 — 0,3/ на синтез люкозоизомеразы и продуктивность биомассы

Продуктивность культуры по глюкозоизомеразе, МГлИЕ/л гит. среды

Биомасса, r влажной биомассы/л пит.

КОН

Среда Концентрация

Д-ксилита, вес. 4 среды

8. 26

118

121

483

8,16

0,01

119

8,23

131 1

1803

1765

131

0,05

8,17

0,10

8,28

113

0,20

8,29

119

0,30

186

531

662

7,72

7,68

183

183

183

0,01

962

1376

1178

7,57

0,05

7,27

0,10

7,89

202

0,20

8,18

8,22

8,24

8,26

8,22

393

894

1358

121

121

119

116

109

О

0,01

0,05

0,10

0,20

7,84

7,86

7,91

7,96

8,17

103

139

111

121

129

Следы

404

1000

1387,01 ,05 ,10 ,20

122

118

134

135

1072

1556

2172

3014

3,74

7,05

6,89

7,43

7,58

7,21

О

0,01

0,05

О, 10

0,20 разе в ксилит среды.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Патент Англии Хо 1395053, кл. С 12 D 13/10, опублик. 1975.

2. Патент США Ме 3654080, кл. С 12 D 13/10, опублик, 1972 (прототип).

Тираж 505 Подписное

Ужгород, ул. Проектная, 4

Формула изобретения

Способ получения глюкозоизомеразы, предусматривающий культивирование микроорганизмов рода Streptomyces на питательной среде, содержащей источник углерода, источник азота, минеральные соли и индуктор биосинтеза глюкозоизомеразы, при температуре 30 С и перемешивании с последующим отделением биомассы, отличающийся тем, что, с целью увеличения продуктивности микроорганизмов по глюкозоизомеВНИИПИ Заказ 9117/32

Филиал ППП «Патент>, г. качестве индуктора используют lI,в концентрации 0,01 — 1,00 о/о от