Способ получения концентрата глюкозоизомеразы

 

Изобретение относится к биотехнологии. Цель изобретения - повышение активности и стабильности целевого продукта. Способ предусматривает проведение кристаллизации глюкозоизомеразы путем добавления к полученному концентрату глюкозоизомеразы, продуцируемой STREPTOMYCES RUBIDINOSIS АТСС 21175 с активностью от 200 до 800 ИГЕ мл, в качестве осадителя водорастворимой соли сульфата магния и/или аммония в количестве от 50 до 170 г/л концентрата, охлаждения смеси до температуры от минус 2 до плюс 13°С для ускорения кристаллизации. Образовавшиеся кристаллы удаляют, и при желании проводят одну или несколько перекристаллизаций добавлением углевода или его концентрированного водного раствора. Получают концентрат глюкозоизомеразы с содержанием углевода от 30 до 60 мас.%, который в дальнейшем может быть использован для иммобилизации глюкозоизомеразы на материале носителе в колоночном реакторе. 2 з.п. ф-лы.

3 1575946 4 бавление всей соли занимает 2-4 ч, Но желаемый результат может быть пслучен добавлением всего количества соли одной порцией, но в этом случае размер кристаллов иэомеразы остается ма" лым.

Раствор охлаждают в течение нес" кольких часов до температуры, приближающейся к температуре замерзания конкретного раствора. Температура замерзания при самой низкой испытанной концентрации сульфата примерно

«-2 С и при самой высокой концентрации

6оставляет +16 С, охлаждение может

Выть начато либо с Одновременным добавлением сульфата, либо после добавления сульфата. Путем постепенного

Охлаждения достигают эффекта кристаллизация — охлаждение, заключающегося в 20 . увеличении размеров кристаллов и в том, что охлаждение уменьшает раствоРимость, что приводит к увеличению выхода.

Кристаллы глюкозоизомеразы отде- 75 ляют путем осаждения их на дно емкости .Фильтрованием или центрифугированием в сепараторах непрерывного действия.

Определенную кристаллическую массу .О смешивают с сухим углеводам или его концентрированным водным раствором, при этом происходит растворение кристаллов глюкозоизомеразы с получением устойчивого концентрата.

При желании кристаллизация может быть повторена и.в этом случа.е кристаллическая масса,цолжна быть растворена.в большом количестве воды с температурой 20-30 С.

Количество воды должно быть таковым„ что активность фермента в растворе составляет 500 - 2000 ИГЕ/мл, т,е. количество воды в 4-10 раэ превышает кристаллическую массу.

Полученные концентраты глюкозоиэомеразы представляют собой чистые, устойчивые, удобные в обращении и летв;одозируемые препараты. Их активность может. регулироваться в пределах от

2000 до 5000 ИГЕ/г;-препарата. 5О

Концентрат глюкозоиэомеразы предпочтительно содержит 30-60 мас.% растворимого в воде углевода, 5-17 мас.% глюкоэоиэомеразы, не более 15 мас,%. сульфата аммония и/или магния и/или 55 буфера с рН 6-8 и воду.

П р и м Р р 1. Посевную культуру

Зtreptomyces tubiginosis ATCC 21175 ферментируют известным способом в 40кубовом ферментере. Клеточную массу лизируют, клеточный остаток удаляют фильтрованием через обычные барабан" ные фильтры с кремнеземом, получая

12 т содержащего глюкозоизомеразу фильтрата. Полученный фильтрат подвергают ультрафильтрации,через ультрафильтр PCI (Pattetson — Candy Inc,) с проницаемостью на уровне 100000 даль-. тон, получая 3000 кг концентрата глюкозоизомеразы с активностью 960000000

ИГЕ, Прошедший через мембрану фильтрат удаляют, К полученному концентрату добавляют 120 кг сульфата магния и 300 кг сульфата аммония. Для ускорения кристаллизации,смесь охлаждают до 10. С, Декантированием отделяют образовавшиеся кристаллы и кристаллизацию повторяют добавлением 411 кг воды, а также 17 кг сульфата магния и 1 кг сульфата аммония. Снова отделяют кристаллы декантированием. Добавлением

452 кг воды кристаллическую массу растворяют и прибавлением 1 М раствора аммиака рН раствора доводят до

6,5, С помощью пластинчатого фильтра раствор отфильтровывают и кристаллизацию повторяют еще раз добавлением

16 кг сульфата магния и 40 кг сульфата аммония, Получают 90 кг крис-..аллической массы, содержащей 20 KJ фермента, 3,7 кг солей, остальное вода. К. кристаллической массе прибавляют 45 кг глюкозы и 45 кг фруктозы, а также 20 кг инвертированного сахара, имеющего содержание сухого вещества 70 мас.%.

В результате получают 200 кг препарата фермента, имеющего состав, мас.%: вода. 29,2, сахар 52< глюкозоизомераза 14,5, соль сульфата магния и аммония 4, 3.

Активность глюкозоизомераэы в концентрате 4500 ИГЕ/г,.

П р и и е р 2. По методике приме-. ра 1 готовят ультрафильтрованный ферментат, K 4000 кг его прибавляют

244 кг кристаллического сульфата аммо" ния, а затем раствор сульфата аммония, содержащего 600 кг соли в 900 л воды. Раствор охлаждают до 13 С и вью держивают при этой температуре 20 ч.

Образовавшуюся кристаллическую массу отделяют в сепараторе фирмы Вестфалиа-Na-7, Кристаллы растворяют в воде и полученный раствор отфильтровы1575946

5 вают с получением 2000 л фильтрата.

Кристаллизацию повторяют использова- нием 122 кг кристаллического сульфа-. та аммония в растворе сульфата аммония, содержащего ЗОО кг сульфата аммония в 460 л воды, Полученную кристаллическую массу вновь отделяют в сепараторе. К 525 кг кристаллической массы прибавляют такое же количество фруктозы кристаллической, затем полученная масса растворяется с частичной изомеризацией фруктозы в глюкозу.

Получают концентрат, содержащий, ! мас. .: сахар 50; фермент 11,2; сульфат аммония 3, 5; вода 35,3. Активность глюкоэоизомераэы в концентрате составляет 3000 ИГЕ/г.

Пример 3. По методике примера 1 приготавливают 4000 л ультрафильтрованного фермента с активностью 240000000 ИГЕ. 5 -ным раствором

Na0H рН доводят до 7,0, температуру Р устанавливают равной 1? С, Для кристаллизации глюкоэокэомеразы в 750 л воды растворяют 500 кг сульфата аммония и полученный раствор прибавляют в течение 2 ч прк равно-. мерной скорости прибазления. Голучен- ный раствор охлаждают до -2 С и перемешивают 24 ч. В сепараторе Вестфалия

Иа-7 отделяют кристаллы глюкоэоиэомераэы. Выход кркстчлкческой массы составляет 290 кг прк содержании в ней 23,6 мас. сухого вещества и активности 2300000000 ИГЕ. К кристаллической массе добавляют 30 кг хлорида натрия и 180 кг глюкозы, рН полученного концентрата фермента устанавливают 7,0 добавлением 5%-ного раствора

ЯаОН, при этом глюко-а частично изомеризуется.

Получают 600 кг устойчивого концентрата фермента, содержащего, мас.Ж: вода 49,7; сахар 30; фермент 12,8; сульфат аммония 2„ 5 и хлорид калия

5. Активность глюкозоизомеразы в концентрате составляет 3400 ИГЕ/г, Пример 4. По методике примера 1 получают 4000 л ферментата с активностью 240000000 ИГЕ. Добавлением

5%-ного раствора устанавливают рН раствора 7 0, температуру - 12 С. Для кристаллизации глюкозоизомеразы в

750 л воды растворяют 500 кг сульфата аммония и полученный. раствор прибавля;.от в течение 2 ч при равномерной ,скорости подачи. Декантированием от- деляют кристаллы глюкоэокэомеразы. б

Получают 230 кг кристаллической массы, содержащей 40 мас. сухих ве- .ществ с активностью 2300000000 ИГЕ.

К кристаллической массе добавляют

115 кг глюкозы и 115 кг фруктозы, а также 50 кг инвертированного сахара с содержанием 70 мас. сухого вещества. Получают. 5 10 кг концентрата глюкоэоизомеразы с содержанием, мас. : вода 30; сахар (глюкоза, фруктоэа)

52; фермент 15, 1; сульфат аммонкя 2,9.

Актквность глюкозоизомеразы в кон«центрате составляет 4500 ИГЕ/г.

H p к M e p 5. По методике примера получают ультрафильтрованный концентрат глюкозоизомеразы, При 25 С к о

0,95 л концентрата кзомеразы с активностью 600 ИГЕ/мл, прибавляют 50 г

20 сульфата аммония, На этой стадии не неблюдается образования ocapKa ° Рас вор охлаждают 16 ч при 0 С и выдержка вают при этой температуре при мягком постоянном помешивании.„Через два дня начинают выпадать кристаллы кзомераэь,, кристаллизация продолжается таким образом, что через пять дней

97,5 мас. изомеразы находятся в кристаллической форме и только 2,5 мас. все еше в растворенной форме в маточном растворе, С помощью лабораторной центрифуги кристаллы отделяют от раствора, получая 56 г влажной кристаллической массы.

Как видно иэ примера, можно выкрис35 таллкзсвать иэомеразу при очень низкой концентрации сульфата аммония по сравнении с количествами, рекомендованными литературными источниками.

В то же время данный пример является

4О примером кристаллизации только под действием охлаждения. В свете данного примера легко понять, что если осаж-. денке под действием сульфата аммония проводить бь:стро и после этого сразу 5 же, напркмер через 15 мкн, отделять осадок в центрифуге, изомераза полностью остается в растворе при применении низкой концентрации сульфата. аммония, Но даже если кзомераза осаждается, 5О ее кристаллизация не наблюдается и прек:,,:щества кристаллизации остаются некспольэованнымк, Кристаллическая масса„ приготовленная в соответствии с настоящим примером, может быть раст55 ворена -очно также, как к в других примерах.

Концентоат глюкозсизомеразы, полу1 ченный согласно изобретению, исполькммобклкэацки глюкоэоиэоме1575946 разы на материале- носитепе в колэночном реакторе.

Составитель И„Привалова

Редактор Л,Пчолинская Техред А»Кравчук Корректор Н,Король

Заказ 1794

Тираж 481

Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб.„ д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r.Óæãoðîä, ул. Гагарина,101

Формула изобретения

1. Способ получения концентрата глюкоз оизомеразы, предусматривающий куль тивирование продуцирующего глюкозоизо- меразу микроорганизма Streptomyces

rubiginosis ATCC r 21175 на питательной среде до достижения максимальной активности, отделение биомассы, лизис клеточной массы с получением бесклеточного экстракта, очистку и концент- 15 рирование экстракта, î f л и ч а юшийся тем, что, с целью повь1шения активности и стабильности целевого продукта, очистку и концентрирова ние экстракта фермента ведут ультра: фильрацией на мембране с проницаемостью на уровне 100000 дальтон с получением концентрата активностью 200—

800 ед ИГЕ/мл, фермент выделяют осаждением водорастворимой солью сульфата магния и/или аммония в количестве

50 - 170 г/л концентрата, смесь охлаждают до температуры от минус 2 до плюс 13 С, способствующей кристаллизации, полученную крйстяллическую мяс-30 су отделяют декантираванием, кристаллы растворяют в воде .и перекристаллизовывают один или несколько раз., к кристаллической массе добавляют у:глевод в виде кристаллов и/или концентрированного раствора в количестве, обеспечивающем содержание его в целевом продукте от 30 до 60 мас.Х, 2. Способ по и» 1, о т л и ч а юшийся тем, что фермент выделяют из концентрата добавлением вначале кристаллического сульфата аммония, а затем раствора сульфата аммония в качестве осадителя с последующим охлаждением, полученную кристаллическую массу отделяют и перекристаллизовывают растворением в воде. полученный раствор фильтруют и добавляют кристаллический сульфат аммония |л его раствор, образованную кристаллическую массу отцеляют и смешивают с фруктозой.

3» Способ по и. о т л и ч я юшийся тем, что фермент выделяют иэ концентрата добавлением сульфата магния, сульфата аммонИя и охлаждением, полученные кристаллы отделяют декантированием и перекристаллизовывают добавлением воды, сульфата магния и сульфата аммония, рН доводят до, б, 5 добавлением разбавленного аммиака. и перекристаллизацию проводят добавлением сульфата магния и сульфата аммония, а затем к кристаллической массе добавляют глюкозу, фруктозу и воду с образованием целевого продукта.

Приоритетпопунктамипризнакам:

25.06.84 по пп, 1-3

06,06.85 по н, 25.06.84 — фермент выделяют осаждением водорастворимой солью сульфата магния и/или аммония в количестве 50170 г/л, а смесь охлаждают От -2 до

+13 С.