Способ выделения лактопероксидазы

 

СПОСОБ ВЬЩЕЛЕНИЯ ЛАКТОПЕРОКСИДАЗЫ из молока .коров, включающий сорбцию сырья па карбоксиметилсефадексе с элюцией 0,02 м m/utf-HCl буфером , содержащим 0,2м NaCl,, при рН 7,4, высаливание фермента сульфатом аммония при 60-70%-ной степени насыщения и иэоэлектрофокусирование, отлич ающийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта и ускорения процесса, из молока предварительно осаждают казеин при рН 4,0-4,5 с отделением осадка центрифугированием, элюат с карбоксиметилсефадекса концентрируют микрофильтрацией в 10-15 раз по сравнению с исходным объемом на мембране из сополимера метилметакрилата (/) и винилпирролидона с диаметром пор 200 + 20А, а изоэлектрофокусирование проводят в линепном градиенте рН 7,410 ,0, который создают борат-полиальными буферными растворами.5 Ю,0 рН S 6 7 8 3 W щ (рроиции

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

ÄÄSUÄÄ 1024501 А

3(5I) С 12 К 9/йр

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ. ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

1 у!

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ - . - l3

Н ABT0PCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ вЂ” (Ю0 рН

9,0

7,0

3 4 5 о 7 8 9 10

N цюонции (21) 3375649/28-13 (22) 30.12.81 (46) 23.06.83. Бюл. Р 23 (72) A.È. Крашенюк, И.И ° Денисова, Г.Ю. Ажицкий, Е.A. Умовская, Ф.С. Носков и Л.Б. Хазенсон (71) Ленинградский ордена Трудового

Красного Знамени научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им.Пастера (53) 577.15.07(088.8) (561 1. 3. Dent. Res. 1972, 51, 503-507.

2. fhorei I 7. I., Yohansson В. G., enzymatic indication of poIypeptides

with >

-"Biochim. Biophys. Acta", 1971, 251, 278.

3. -Троицкий Г.В. и .др., ДАН СССР, 1974, 214, 955-958. ОЮО 0,090

0050

Ъ 0,0

< ао

0,0 ф 00

0.0 (54) (57) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ JIAKTOIIEPOK

СИДАЗЫ из молока .коров, включающий сорбцию сырья «а карбокснметилсефадексе с элвцией 0,02 И иф -HС1 буфером, содержащим 0,2 И ИаС1, при рН 7,4, высаливание фермента сульфатом аммония при 60-70%-ной степени насыщения и изоэлектрофокусирование, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта и ускорения процесса, из молока предварительно осаждают каэеин при рН 4,0-4,5 с отделением осадка центрифугированием, элюат с карбоксиметилсефадекса концентрируют микрофильтрацией в 10-15 раэ по сравнению с исходным объемом «а мембране из сополимера метилметакрилата и винилпирролидона с диаметром пор

200 + 20А, а изоэлектрофокусирование проводят в линейном градиенте рН 7,4

10,0, который создают борат-полиальными буферными растворами.

1024 01

Изобретение относится к биохимической промышленности, а именно к получению особо чистых биохимических препаратов и может бить использова но в научно-исследовательской работе.

Лактопероксидаэа применяется для иоднрования белков и липидов, при поставке радиоиммунологического метода исследования (РИИ), иммуноферментного метода. Ее бактерицидные свойства могут быть использованы lO для стерилизации молочных продуктов.

Известны способы выделения и очистки лактопероксидазы (ЛПО) из слюны человека н молока крупного рогатого скота с помощью комбинации методов: ионнообменной хроматографии, гельхроматограФии на сефадексах, висйли- . вания сульфатом аммония, иэоэлектрофокусирования на амфолитах f1)

Наиболее близким по технической ;и) сущности является способ выделения лактопероксидазы нз молока коров путем сорбцин сырья на карбоксиметилсефадексе, элюции 0,02И ж) ис-НС1 буФером, рН 7,4, содержащим 0,2 И 25

NaC1, высаливания фермента иэ элюата сульфатом аммония при степени на- i сыщения бО-70% н изоэлектрофокусирования на амфолитах (2) .

Однако на этапе сорбции лактопе- у) роксидазы ЛПС) íà КИ-cефaдекce казеин выпадает в осадок. Твердые частицы казеина способствуют агреГацнн сефадекса, чтд препятствует присоединению лактопероксидазы, затрудняет ее последующую элюцию и исключает возможность многократного использования КИ-сефадекса.

Низкая концентрация белка в элюате jìàòåðèàë после ноннообменной хроматограФии) приводит к его потерям при дробном высалнвании сульфатом аммония, так как при добавлении соли

Образуется тонкая взвесь белка, ко торую трудно полностью извлечь нз раствора. 45

Изоэлектрофокусирование на амфолитах - длительный процесс, так как естественный градиент pH { на основе полиаминополикарбоновых кислот) образуется в результате 20-часового предварительного электрофореэа, а весь процесс разделения белков на амфолитах занимает около 60 ч. В результате выход целевого продукта недостаточно висок, а продолжительность способа длительна.

Цель изобретения - повьааение выхода целевого продукта и ускорение способа его выделения.

Указанная цель достигается тем, 60 что согласно способу выделения,лактопероксидаэы нз молока коров, включающему сорбцию сырья на карбоксиметнлсефадексе с элюцией 0,02 И м рмС-НС1 буфером, при рН 7,4, содер- 65 жащим 0,2 И NaC1, висаливание фермента сульфатом,аьмония при 60-70%-ной степени насыщения и иэозлектрофокусированне, предварительно осаждают казеин из молока при рН 4,0-4,5 с отделением осадка центрифугированием, концентрируют элюат микрофильтрацией в 10-15 раэ по сравнению с исходным объемом на мембране из сополимера метилметакрилата и винилпирролидона с диаметром пор 200 + 20A, и проводят изоэлектрофокусирование в линейном градиенте рН 7,4-10,0, который создают борат-полиольными буферными растворами.

Удаление казеина из молока перед сорбцией ЛПО на КИ-сефадексе способствует. увеличению емкости ионообменника по целевому продукту (казеин в данном случае является балластным белком), что приводит к повышению выхода ЛПО и ускорению процесса сорбции и дальнейшему выделению.

Концентрирование элюата (раствора белка, десорбированного с КИ-сефадекса) позволяет сократить потери белка при последуккцеи высаливании сульфатом аммония, благодаря образованию более плотного осадка н, следовательно, более полному отделению его, и сократить длительность процесса. Введение этого этапа в способе выделения и очистки ЛПО также приводит к повышению выхода целевого продукта.

Проведение изоэлектрофокусирова ння не в естественном градиенте рН (устанавливается в процессе электро« фореза амфолитов), а в искусственном градиенте рН (устанавливается путем искусственного последовательного наслоения борат-полнольных буферных растворов с различными значениями рН) в диапазоне рН 7,4-10,0 ускоряет и удешевляет способ. Это позволяет также избежать основных потерь активности при сокращении длительности процесса. Проведение одного опыта предлагаемым способом в 100-120 раэ дешевле по сравнению с известным способом. Создание искусственного линейного градиента рН занимает около 30 мин, а процесс разделения белков в этом градиенте рН длится 2024 ч.

Термином "искусственный градиент рН" пользуются в методе изоэлектрофокусирования в борат-цолиольных буферных системах для того, чтобы подчеркнуть его принципиальное отличие от электрофокусирования в амфолитах (3 ).

Пример 1 . Для выделения

ЛПО берут б л коровьего молока, которое хранят при температуре -20 С °

Молоко предварительно обезжирнвают центрифугированием при 300 об/мин в

1024501 течение 30 мин на центрифуге S — 70 (2600 g) .

Казеин осаждают при рН 4,0-4,5 установленном с помощью 0,5 M раствора НС1, рН в растворах определяют с помощью рН-метра ЛПУ - 01. Осадок казеина отделяют центрифугированием при 300 o6/мин в течение 20 мин на центрифуге 8-70. Затеи к молочной сыворотке добавляют сухой необработанный КИ-сефадекс С-50 из расчета

2 г на 1 л сыворотки. Сорбцию ЛПО на ионообменном сефадексе ведут в течение 5 ч при комнатной температуре при постоянном перемешивании.

Сефадекс отделяют на воронке Бюхне- (5 ра и проымвают 2 л воды, а к фильтрату добавляют новую порцию cehaдекса и рроводят повторную сорбцию

ЛПО.

ЛПО элюируют на воронке Бюхнера

0,02 Мщу-НС1 буфером, содержащим

0,2 И ЯаС1 (рН буфера соответствует рН молочной сыворотки, отделенной от сефадекса). Буфер порциями по

50 мл осторожно наслаивают на сефадекс и через 10-15 мин отсасывают под вакуумом при давлении 0,02 атм.

Элюацию заканчивают, когда оптическая плотность элюата при длине волны

412. нм становится равной нулю. Сефадекс после окончания элюации регенерируют, обрабатывая его йоследовательно 0,5 М NaOH и 0,5 И НС1, и используют в дальнейших опытах.

Элюат (1 л) концентрируют микрофильтрацией на мембране "Рипор-3" до 100 мл с помощью прибора ФМ-01 под давлением 4 атм. . Концентрированный элват подвергают дробному высаливанию сульфатом аммония. Осадок белка (55„8 мг, 40 полученный в пределах насыщения элюата сульфатом аммония 60-80% (грубая ЛПО), диализуют в течение суток против проточной воды и в течение суток против буфера 0,3 И борная кислота 0,33 11eqme; рН 8,3 и используют для изоэлектрофокусирования в искусственном рН-градиенте.

Искусственный градиент рН 7,4

10,0 создают следующим образом.

Буферные растворы с рН 7,4-8,3 готовят, добавляя к основному буферному раствору О,З М борная кислота9 33 М7ярж, рН 8,3 глицерин, дотитровывая раствор до требуемой величины рН. Буферные растворы с рН 8,3-10,0 готовят путем подщелачивания основного буферного раствора аммиаком, Буферные растворы с рН 7,4; 7,бу

7,8; 8 ° 1; 8,3 8,5; 8,7 9,0 9,2у 60

9,4; 9,6; 10,0 объемом по 2,5 мл последовательно: наслаивают с помо" щью перистальтического насоса в аналитическую колонку для изоэлектрофокусирования. 65

r Грубую ЛПО наносят в объеме 0,5 мл (2,0 мг белка, удельная активность

0,350) после буферного раствора с рЙ 7,8, соответствующего раствору по плотности, которую определяют на рефрактометре РПЛ-Ç.

В качестве электродного буфера используют основной буферный раствор:

0,3 И борная кислота — 0,33 Мйгрмс-, рН 8,3. изоэлектрическое фокусирование проводят в аналитической колонке объемом 50,0 мл в течение 16 ч. Напряжение на электродах 750 В (градиент напряжения 15 В/см) создают с помощью источника постоянного тока.

После окончания электрофореза содержание колонки отбирают сверхУ фракциями объемом по 3 мл. Фракции дна" лизуют против 0,85%-ного раствора

NaC1, определяют в них концентрацию белка и ферментативную активность, рассчитывают удельную активность фермента и строят злектрофореграммы.

Степень очистки препарата после изоэлектрофокусирования определяют методом злектрофореза в 7,5%-ном полиакриламидном геле в кислой среде, рН 3,2.

Результаты опыта представлены на фиг. 1. Белок проявляет наибольшую пероксидазную активность в двух зонах: с рН 8,1 и рН 9,9. Белок с изоэлектрической точкой 9,9 образует при электрофоретическом разделе"

«нии в полиакриламидном геле одну сдвоенную полосу (фиг. 2). В коммерческом препарате ЛПО, выпускаемой фирмой "S1gma", наблюдаются две дополнительные диффузные белковые зоны, обнаруживаемые в препарате грубой ЛПО и отделяемые при изоэлектрофокусировании в. искусственном линейном градиенте рН 7,4-10,0.

Общее количество препарата, получаемое в одном опыте, составляет

i1 9 мг.(материал с 25 аналитических колонок для изоэлектрофокусирования). б

Пример 2 . Выделение в очистку проводят аналогично примеру 1. Отличия заключаются в концентрировании элюата микрофильтрацией в 15 раз, что не приводит к существенному увеличению количества белка,,осаждаемого на последующем этапе выделения, и в изменении нагрузки на колонку. Для очистки нзоэлект рофокусированием в одну аналитическую колонку вносят 4,0 мг белка.

Результаты опыта представлены на фиг. 3. Максимальную удельную активность проявляют белки с изоэлектрическими точками 8,0 и 9,9, что является свидетельством хорошей воспроизводимости получаемых резуль" татов, приведенных в примере 1. Не большой пик с изоэлектрической точ1024501

Показатели

Препарат предлагаемом известном

200

0,98

9,3

1,9

1,9

0,2

Выход ЛПО

Степень чистоты (см. Фиг. 2) Одна сдвоенная полоса (злектрофорез н ПААГ ) кой 8,05 образуется, возможно, при большей нагрузке на колонку за счет минорного компонента грубой ЛПО.

С одной аналитической колонки н данном опыте получают 400 мкг белка.

Сорбция на КИ-сефа- Элюат с КМдексе. сефадекса

Дробное высалива- Грубая ЛПО ние сульфатом аммония

Изоэлектрофокуси- Очищенная ЛПО рование

Таким образом, предлагаемый спо-. соб выделения и очистки ЛПО позволяет повысить выход ЛПО приблизительно н 10 раэ по сравнению с известным см.,таблицу), благодаря более полной сорбции ЛПО на КИ-сефадексе и последующей ее элюации, а также в результате сокращейия потерь белка на этапе дробного высалинания сульфатом аммония; ускорить процесс выделения и очистки ЛПО н два раза

Показатели общего количества белка, йолучаемого из 1 л короньего молока на различных стадиях выделения и очистки лактопероксидазы (ЛПО) принедены и таблице.

Общее количество белка, мг в способе

Одна сдвоенная полоса и 2 диффузные зоны (электрофорез в ПААГУ эа счет иэоэлектрофокусирования в

35 искусственном рН-градиенте; понизить стоимость выделения и очистки ЛПО, благодаря многократному использованию КИ-сефадекса и применению дешевых отечественных реактинон для

4п создания рН-градиента. Эксперимент по изоэлектрофокусиронанию на амфолитах стоит 28 руб °, а н искусственном рН-градиенте

40 ком, 1024501

6рн

8,0

7,5

7 8 3 Ю и р акцЮ

Фиг. Я

Составитель О. Скородумова

Техред А.Бабинец Корректор О. Билак

Редактор Н. Гунько

Заказ 4336/24 " Тираж 523 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4