Литиевая соль @ -хлорацетилгидразона оксогуанозин-5- трифосфата для специфического ингибирования аденилатциклазной активности,стимулируемой гуаниловыми нуклеотидами

 

Литиевая соль N-хлорацетилгидразона оксогуанозин-5-трифосфата ф01Ж1улы (I)О 6 О О II Я В йПГ J но-р-0-Р-о-р-о-сн, .t I . f . i . 1 OLl OU OLl 1,0, для специфического ингибирования аденилатциклаэнрй активности, стимулируемой гуаниловыми нуклеотидами. уевкщ

СОЮЗ СОВЕТСКИХ .

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

09) (11%

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н ABTOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3328700/23-04 (22). 17.08.81

:(46) 15.07.83. Бюл. Р 26 ,(72) 10.В.Хропов, А.В.Скурат, О.A.Áoãoìoëoâa и Н.Н.Гуляев (71) Иосковскйй ордена Ленина, ордена Октябрьской Революции и ордена ТрудовОго Красного Знамени государственный университет им.M.B.Ëoмо носов а (53) 547.917(088.8) (56) 1. Бр1еце6 A.M., Downs R.W., Aurbach Jr.G.D. Separation of à Guanine Nucteog1de Regulatory Unit егоm

The AdenyCate Cycfase Complex With

GTP Affinity Chromatography. Journal

of Сус61с Nucleotide Research, 5, 3-17 (1979).

2. Hannsske Р., Cramer F. Untersuchungen zur Struktur Perjodatoxydieter Н1Ьо цс(еоя1йе цпй. RibonucfеоИde. — "Carbohydrate Pesearch", 54, 75-84 (197?).

Э(51) С 07 Н 19/20; A 61 К 49/00 (54) ЛИТИЕВАЯ СОЛЬ Н-ХЛОРАЦЕТИЛГИДРАЗОНА ОКСОГУАНОЗИН-5-ТРИФОСФАТА

ДЛЯ СПЕЦИФИЧЕСКОГО ИНГИБИРОВАНИЯ ЪДЕ. .НИЛАТЦИКЛАЗНОИ АКТИВНОСТИ СТИМУЛИРУЕМОЙ ГУАНИЛОВЫМИ НУКЛЕОТИДАИИе (57) Литиевая соль N-хлорацетилгидразона оксогуанозин-5 -трифосфата формулы (g)

0 О 0 M щ

II (! )! !! 1

НО-Р— О-P — 0-P-0- СН Ю Ф ЗЖ %

0li OLI ОЬ1 0

Н0, аН мн g

О . для сцецифического ингибирования аденилатциклазной активности, стиму:лируемой гуаниловыми нуклеотидами.

1028675

Изобретение относится к новому химическому соединению соли - N-хлор"

t аиетилгидразон оксогуанозин-5 -трифосфата (оксо-ГТФ) формулы

О 5 а 0 О К щ

I 1

Z0- P- O-P-O-Р-O— - CK .3

З

01i 0Li 0Li . 0

,) 10

Н0, аН, ЗН

С 0

1 (К

15 для специфического ингибирования аденилатциклаэной активности, стиму- 70 лируемой гуаниловыми нуклеотидами.

Данное соединение является специфическим регулятором аденилатциклазной системы и может быть использовано в биохимических исследованиях для изучения строения и механизма действия данного фермента, а также в медицине-для изменения в клетках различных тканей уровня циклического аденоэин-3, 5 -монофосфата, который является продуктом аденилатциклазной реакции и играет роль регулятора многих биохимических процессов °

Известен N-изоникотиноилгидразон оксо-,ГТФ l l j

0!

C=0

50

Соединение охрактериэовано хроматографической подвижностью при тонкослойной хроматографии на пластинках с полиэтилениминцеллюлозой в 1 М ,растворе хлористого лития Rg- =0,04 и на пластинках S18ufot в системе диоксан-аммиак-вода (6:4:1) R 0,15.

Соединение охарактеризовано элект-, 60 рофоретической подвижностью при высоковольтном электрофорезе на бумаге Ф 1 в 0,05 М литий-ацетатном буфере (рН 3,7) -,. Ео относительно

ГМФ = 2,0 в 0,05 М цитратном буфере

65 (рН 6,5) - Е относительно ГМФ=1,8..

0 0 0 У 1щ

Н .И П ((I

H0 — Р-0 — P 0 — Р— 0- СН2 М ЮЛИАН ока аида Она 0

ZO +(0Н

М

Однако это соединение не содер- жит реакционноспособной группировки и не оказывает ингибирующего действия на аденилатциклазную активность, стимулируемую гуаниловыми нуклеотидами.

Цель изобретения - изыскание нового соединения, позволяющего расширить ассортимент специфических регуляторов аденилатциклазной активности.

Поставленная цель достигается свойствами нового соединения - литиевой соли N-хлорацетилгидраэона оксогуанозин-5 -трифосфата формулы (I ), которое является специфическим ингибитором аденилатциклазной активности, стимулируемой гуаниловы" ми нуклеотидами.

Соединение формулы ()) получается синтезом, основанным на известной реакции диальдегидных производных, полученных периодатньм окислением нуклеотидов, с моноацилгидраэи,цами (.2 j и заключающимся во взаимо,цействии окисленного периодатом натрия ГТФ (оксо-ГТФ) с хлоргидратом

N-хлорацетилгидразида в литий-ацетатном буфере (рН 5) °

Пример 1. Литиевая соль

N-хлорацетилгидразона оксо-ГТФ.

176,5 мг (0,825 ммоль) периодата натрия растворяют в 2 мл воды,добавляют 400 мг (0,75 ммоль) тетранатриевой соли гуанозин-5 -трифосфата.и полученный раствор перемешивают 1 ч при 4о С, защищая его от доступа света. После этого к реакционной смеси прибавляют 0,5 мл этиленгликоля и оставляют на 30 мин.

Далее раствор при 4 С наносят.на колонку с сефадексом G-10 (2 75 см), уравновешенным водой. Элюцию оксо-ГТФ проводят водой. Фракции, обладающие поглощением mph 260. нм и не содер>кащие примеси иодат-ионов (JO>+5J +

+ 6Н - 37 + 3H O), объединяют и упа+ ривают досуха при пониженном давле,о нии и температуре водяной бани 35 С.

Остаток растворяют в 2 мл 0,25 M литий-ацетатного буфера (pH 5) и при охлаждении до 4 С добавляют

116 мг (0,8 ммоль) хлоргидрата N-хлорацетилгидразида. Раствор перемещивают 2 ч при 4 С и обрабатывают 20 мл охлажденного этанола. Выпавший осадок центрифугируют, промывают этанолом и высушивают в вакууме над пятиокисью фосфора. Получают 235 мг литиевой соли N-хлорацетилгидразона оксо-ГТФ. Выхог 47%.

Найдено, В: С 21,92; Н 2,95;

P 13,77; С8 5,1 0 °

С„ Н „ь С8 Н, О„,. Р, Li g H O

Вычислено, 3: C 21,66; Н 2,73;

9 13,961 С 5,33, 1028675

Соединение обладает характерным для гуаниловых нуклеотидов УФ-спектром: ъ ) ща = 252 нм,Ы щд,=13,1" 10 М см (рН 7) .

Ингибирование аденилатциклазной ак тив ности, стимулируемой гуаниловыми нуклеотидами, изучают следующим образом.

Мембранный препарат аденилатциклазы )КФ 4.6.1.1. АТФ-пирофосфатлиаза (циклизующая) (АЦ) получают из хвостового ядр,. мозга быка известными методами. Активность фермента определяют по образованию P-цАМФ (цикличес 3 кий аденозин-3, 5 -монофосфат) из . 15

> . ( с(.- Р) АТФ, (30 Ки/ммоль) .

Ингибирование N-хлорацетилгидразоном оксо-ГТФ стимуляции реакции синтеза цАМФ под действием гуанилил5 -метилендифосфоната проводят в стандартных условиях при 22 С. Преинкубацию Н-xлоpaцетилrидразoнa оксо-.

ГТФ в концентрации 10 М с мембранным препаратом АЦ проводят в течение различных интервалов времени в 20 MN на- 5 трийборатном буфере (рН 8,0), содержащем 0,1 мМ ЭГТА (этиленбис-(оксиэтиленнятрило)-тетрауксусная кислота), 1 мМ дитиотрейтол, 10 мМ MgC и 8 мг/мл белка мембран. Преинкубацию останавливают 50-кратным разведением тем же буфером, охлажденным до 4 С. После этого пробы центрифугируют

10 мин при 10000 об/мин и осадок мембран суспендируют в среде разведением до концентрации белка 8 мг/мл. Мем 5 браны, преинкубированные в отсутствие Я-хлорацетилгидразона оксо-ГТФ, обрабатывают аналогично. Затем проводят .активацию АЦ добавлением водного раствора гуанилил-5 -метиленди- 40 фосфоната до концентрации 5" 10 + М и после преинкубации с активатором в течение 15 мин при 37ОС определяют количество Р- цАМФ„ образующегося за 6 мин при 37 С. Для этого 25 мкл 4 смеси обработанного мембранного препарата добавляют к 25 мкл среды ин» кубации, содержащей 100 мМ трис HC(, (PH 8,0), 20 мМ NgC+ 2 мМ ЭГТА, 4 мМ цАМФ, 0,2 мМ АТФ, 40 мм теофиллина, 2 мг/мл креатинкиназы, 40 мМ креатинфосфата и ф — Р1 АТФ

;(250000 имп/мин.). Защитный эффект гуанилил-5 -метилендифосфоната от действия И-хлорацетилгидразона оксоГТФ наблюдают после добавления водного раствора гуанилил-5 -метиленди фосфоиата до концентрации 2 10 М к среде преинкубации, содержащей .мембранный препарат АЦ (конечный объем пробы 20 мкл), и выдерживания в течение 15 мин при 37 С. За,тем добавляют 5 мкл 5 10 М раство. ра N-хлорацетилгидразона оксо-ГТФ и (преинкубируют в течение различных интервалов времени при 20 С, после чего определяют образование Р-цАМФ по указанной методике.

Активация мембранного препарата

АЦ с помощью гуанйлил-5 -метиленди-! фосфоната в концентрации 2 ° 10 M приводит к увеличению активности фермента в 3,5 раза по сравнению с базальным уровнем активности.

Ингибирование фермента определяют по следующей формуле:

100а, где И вЂ” стимулированная гуанилил-51 метилендифосфонатом активность АЦ после обработки

N-хлорацетилгидразоном оксоГТФ; а — стимулированная гуанилил-5 ! метилендифосфонатом активность АЦу б — базальная активность АЦ.

На фиг.l показана зависимость активации аденилатциклазы, стимулированной гуанилил-5 -метилендифосфонатом (0,5 мМ, 15 мин, 37 С), от времени предварительной инкубации, фермента с N-хлорацетилгидразоном оксо-ГТФ (1 мМ, 22 С); на .фиг.2 зависимость активации аденилатциклазы от времени преинкубации N-хлорацетилгидразона оксо-ГТФ (1 мМ, 22 С) с ферментом, предварительно активированным гуанилил-5 -метилендифосфонатом ! (0,2 мМ, 15 мин, 37 С) .

Как следует из фиг.l, .за 3 ч преннкубации с N-Хлорацетилгидразоном.оксо-ГТФ АЦ практически полностью утрачивают способность к стимуляции гуанилил-5 -метилендифосфонатом. При этом эффект увеличивается с течением времени, что говорит о необратимом связывании N-хлорацетилгидразона с одним из компонентов АЦ-системы. При предварительной преинкубации мембран с.гуанилил-5/ метилендифосфонатом с последующей обработкой N-хлорацетилгидразоном оксо-ГТФ ингибируяхций эффект заметно снижается (фиг.2), что указывает на специфическое взаимодействие предлагаемого соединения с ГТФ-свя,зывающим центром аденилатциклазной системы, в результате чего утрачивается способность АЦ к регуляции гуаниловыми нуклеотидами.

>80

Ь <оо

Ъ

М

Ю

Ф ,ф Я

6фенлф еинкцбации е

Мг

Составитель Л.Никулина

Редактор Т.Веселова Техред И.Гай у Корректор А "Повх

Заказ:4889/22 Тираж 387 Подписное

BHHHIIH Государственного комитета СССР по делам иэобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент, r. Ужгород, ул. Проектная, 4