Способ культивирования каллусной ткани жень-шеняпродуцента биологически активных веществ

 

СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КАЛЛУСНОЙ ТКАНИ ЖЕНЬ-ШЕНЯ - ПРОДУЦЕНТА БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ путеы выращивания посевного материала на питательной среде с кинетином с последующим пересевом на питательную среду и отбором выросшей биомассы для вьщеления биологически активных веществ , отличающийся тем, что, с целью повышения выхода биологически активных веществ, посевной материал пересевают на питательную среду, содержащую (мг/л воды) сахарозу 25000-35000, тиамин-хлорид 0,3 0 ,6, мезоинозит 70-90, f-нафтилуксусную кислоту 1,5-2,5, никотиновую кислоту 1,5-2,5, агар-агар 5500-6500, хелат 4,5-5,5, макроэлементы по Мурасиге и Скуту 4,5-4,57-10, микроэлементы по Мурасиге и Скугу 38-38,22, отбирают часть вьфосшей биомассы, а оставшуюся часть биомассы исполь (Л зуют на стадии выращивания посевного материала.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

A@4 С 12 М 5/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ .

Н ABTOPCHOIVIV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Р%

° °

° °

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3382730/28-13 (22) 18.01.82 (46) 30.04.87, Бюл. у (7 1) Всесоюзный научно-исследователь ский биотехнический институт (72) А.Н.Данилина, И.В.Александрова, А.А.Складнев, И.В,Никитина, А.П.Медникова и В,В.Дурова (53) д578.085.23(088,8) (56) Высоцкая Р.И. Культура ткани жень-шеня (биология и перспектива использования в медицине). Канд, дис.

Л,, 1978. (54)(57) СПОСОБ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КАЛЛУСНОИ ТКАНИ ЖЕНЬ-ШЕНЯ - ПРОДУЦЕНТА

БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ путем выращивания посевного материала на питательной среде с кинетином с пос.Я0„„1036053 A

4 ледующим пересевом на питательную среду и отбором выросшей биомассы для выделения биологически активных ве.ществ, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода биологически активных веществ, посевной материал пересевают на питательную среду, содержащую (мг/л воды) сахарозу 25000-35000, тиамин-хлорид 0,3—

0,6, мезоинозит 70-90, g-íàôòèëóêñóñную кислоту 1,5-2,5, никотиновую кислоту 1,5-2,5, агар-агар 5500-6500, хелат 4,5-5,5, макроэлементы по Мурасиге и Скугу 4,5-4,57.10 микроэлементы по Мурасиге и Скугу 38-38,22, отбирают часть выросшей биомассы, Е а оставшуюся часть биомассы используют на стадии выращивания посевного материала.

1 10360

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается технологии получения и выращивания пересадочных культур растительных тканей, используемых в качестве продуцентов биологически активных веществ в различных отраслях промышленности.

Известен способ культивирования каллусной ткани жень-шеня — продуцента биологически активных веществ пу- 10 тем выращивания посевного материала на питательной среде с кинетином с последующим пересевом на питательную среду и отбором выросшей биомассы для выделения биологически активных 15 веществ.

Однако известный способ не обеспечивает высокого выхода биологически активных веществ.

Целью изобретения является повыше- 20 ние выхода биологически активных веществ.

Цель достигается тем, что в способе культивирования каллусной ткани жень-шеня — продуцента биологически активных веществ путем выращивания посевного материала на питательной среде с кинетином с последующим пересевом на питательную среду и отбором выросшей биомассы для выделения биологически активных веществ отличительной особенностью является то, что посевной материал пересевают на питательную среду, содержащую (мг/л воды) сахароэу 25000-35000, тиамин-хлорид

0,3-0,6, мезоинозит 70-90, Р -нафтилуксусную кислоту 1,5-2,5, никотиновую кислоту 1,5-2,5, агар-агар 5500-6500, хелат 4,5-5,5, макроэлементы по Мурасиге и Скугу 4,5-4,57 .10> микро- 40 элементы по Мурасиге и Скугу 38—

38,22, отбирают часть выросшей биомассы, а оставшуюся часть биомассы используют на стадии выращивания посевного материала. 45

Способ осуществляют следующим образом.

Приготавливают питательную среду.

Затем разливают питательную среду в емкости для культивирования, Сте- рилизуют емкости с питательной средой. После этого культивируют каллусную ткань, пересаживают часть выращенной ткани (1/10 от общего объема) на свежую питательную среду того же состава. Затем пересаживают выращенную ткань (9/10 от урожая) на модифицированную питательную среду.

53 2

Модифицированная питательная среда содержит микроэлементы по Мурасиге и Скугу, микроэлементы по Мурасиге и Скугу, сахарозу, тиамин-хлорид, мезоинозит, гидролизат казеина, нафтилуксусную кислоту, никотиновую кислоту, агар-агар, железо †хел.

Культивируют пересаженную ткань на модифицированной питательной среде, при этом предусматривается возможность многократного выращивания на модифицированной среде до тех пор, пока биологическая активность биомассы не станет минимальной. После этого биомассу пересаживают на полную питательную среду Мурасиге и

Скугу и используют в дальнейшем как инокулюм.

Затем отбирают и высушивают каллусную ткань, растущую на модифицированной среде, экстрагируют и получают биологически активные вещества из каллусной ткани, культивируемой на модифицированной среде.

Пример 1 (контроль). Процесс получения биологически активных веществ включает ряд операций, Приготавливают питательную среду.

Используют среду Мурасиге и Скугу следующего состава:

Макроэлементы по Мурасиге и Скугу

Микроэлементы по Мурасиге и Скугу

Сахароза 30000 мг/л

Тиамин-хлорид 0,4 мг/л

Мезоинозит 80 мг/л

Гидролизат казеина 500 мг/л

Кинетин 1 мг/л

f-Нафтилуксусная кислота 2 мг/л

Агар-агар 6000 мг/л

Fe-хелат 5 мг/л

В тщательно вымытые культивационные флаконы разливают по 250 мл питательной среды, Флаконы со средой укупоривают и автоклавируют для уничтожения микроорганизмов.

Бокс стерилизуют бактерицидными лампами, инструменты в суховоздушном шкафу при 150-200 С завертывают в бумагу Крафт.

Затем стерильными инструментами материал извлекают из флакона и пересаживают в подготовленные флаконы со средой по 1 г ° Флаконы укупоривают и переносят в культивационную комнату, где стабильно. поддерживается температура +26 C и влажность 70Х, от—

1,5 мг/л

3 10360 сутствует свет. Цикл культивирования

30 сут.

Снимают урожай для получения биологически активных веществ. 1/10 часть. выращенной биомассы используют в качестве инокулюма, пересаживая на свежую питательную среду того же состава. 9/10 высушивают и экстрагируют биологически активные вещества этиловым спиртом при соотношении сырье: f0 экстрагент 1:10, Определяют прирост биомассы биологически активных веществ и продуктивности. Для контроля за ростом культуры и выходом биологически активных f5 веществ проводят определение сухого веса (не менее пяти повторностей), суммы гликозидов (биологически, активных веществ) весовым методом и продуктивности. 20

Сухой вес биомассы 10,44 г/л.

Сумма гликозидов 4,2Х.

Продуктивность биомассы 438,5 мг/л.

Пример 2, Получение биологически активных веществ из каллусной ткани, растущей на модифицированной среде Мурасиге и Скуга содержащей:

Макросоли по Мурасиге и Скугу

Микроэлементы по Мурасиге и Скугу 30

Сахарозу 25000 мг/л

Тиамин-хлорид 0,3 мг/л

Мезоинозит 70 мг/л

Гидролизат казеина 450 мг/л (-Нафтилуксусную кислоту

Никотиновую кислоту 1,5 мг/л

Агар-агар 5500 мг/л

Fe-хелат 4,5 мг/л

Операции культивирования и полу чения биологически активных веществ описаны в примере 1.

На данной среде выход биомассы по сухому весу 10,3 г/л, биологически45 активных веществ (суммы гликозидов)

4,15Х, продуктивность 427.,5 мг/л.

Пример 3. Получение биологически активных веществ из каллусной ,е ткани, растущей на модифицированной среде Мурасиге и Скуга следующего состава:

Макросоли по Мурасиге и Скугу

Микроэлементы по Мурасиге и Скугу

Сахароза 30000 мг/л

Тиамин-хлорид 0,4 мг/л

Мезоинозит 80 мг/л

Гидролизат казеина 500 мг/л

53 4

1-Нафтилуксусная кислота 2 мг/л

Никотиновая кислота 2 мг/л

Агар-агар 6000 мг/л

Fe-Хелат 5 мг/л

Операции по культивированию и получению биологически активных веществ описаны в примере 1.

Выход сухой биомассы жень-шеня составляет 11,8 г/л, биологически ак- . тивных веществ — 4,18Х, продуктивность — 493,3 мг/л, Среда обеспечивает наиболее высокий выход биомассы и соответственно наибольший выход биологически активных веществ.

Пример 4. Получение биологически активных веществ из каллусной ткани, растущей на питательной среде следующего состава:

Макросоли по Мурасиге и Скугу

Сахароза 35000 мг/л

Тиамин-хлорид 0,6 мг/л

Мезоинозит 90 мг/л

Гидролизат казеина 550 мг/л (-Нафтилуксусная кислота 2,5 мг/л

Никотиновая кислота 2,5 мг/л

Агар-агар 6500 мг/л

Fe-хелат 5,5 мг/л

Описание операций по культивированию и получению биологически активных веществ приведено в примере 1, На этой среде выход биомассы по сухому весу 11,65 г/л, суммы гликозидов — 4,05Х, продуктивность

471,8 мг/л.

Пример 5. Культивирование каллусной ткани и получение из нее биологически активных веществ при многократном использовании модифицированной питательной среды, указанной в примере 3 °

Подробные операции по культивированию и получению биологически активных веществ описаны в примере 1. При одно" кратном культивировании (1 пассаж) выход сухой биомассы 11,80 г/л, суммы глигозидов — 4,18Х, продуктивность — 493,3 мг/л.

При двукратном культивировании (II пассажа) выход сухой биомассы

13,15 г/л, суммы гликозидов — 3,25Х, продуктивность — 427,4 мг/л.

При трехкратном культивировании (III пассажа) выход сухой биомассы

13,97 г/л, суммы гликозидов — 2,9Х, продуктивность — 405,1 мг/л.

Редактор П.Горькова

ТехРед И.Попович

Корректор-А.Обручар

Подписное

Тираж 500 о

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб,, д, 4/5

Заказ 1649/3

Производственно-полиграфическое предприятие, г.ужгород, уд,Проектная, 4

5 1036053 6

При четырехкратном культивирова- 12,53 г/л, суммы гликозидов — 2,5Ж нии (IV пассажа) выход сухой биомас- продуктивность 313,2 мг/л. сы 13,56 г/л, сумма гликозидов— Предложенный способ позволяет уве2,5Х, продуктивность — 339,0 мг/л. личить вв|ход биологически активных веществ на 357 по сравнению с известПри пятикратном культивировании ным, а также сократить расход кинети; (V пассажей) выход сухой биомассы на в 10 раз.