Способ подготовки пробы культуры растительной ткани к цитометрическому анализу

 

СПОСОБ ПОДГОТОВКИ ПРОБЫ КУЛЬТУРЫ РАСТИТЕЛЬНОЙ ТКАНИ К ЦИТОМЕТРИЧЕСКОМУ АНАЛИЗУ путем обработки пробы мацерирующим раствором с последующим окрашиванием мацерата метипеяовым синим, отличающийся .тем, что, с целью предотвращенияповреждения клеток и повышения степени сохранения их жизнестойкости, исполь зуют мацерирующий раствор следующего состава, мае. %: 1,95-2,05 Кальций хлористый 2,45-2,55 Пектиназа Г10Х 4,95-5,05 Целлокандин ГЗХ Остальное Вода дистиллированная причем обработку пробы мацерирующим раствором ведут при температуре 26±1°С в течение 4-5 ч при объемном соотношении пробы и мацерирующего раствора 1:1. (Л с О, со ;о со ел со (J о - о о Оо О СП аупрощенные дзигурь 5- марообразные фигуры

СОЮЭ СО8ЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК,.SU„„999595

- 1 у 4 С 12 N 5/00

0 д о Q

0 оо

u — улрощенные цидулки д — игароод эоэ4ме фи8фю

ГОСУДАРСТ8ЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР (21) 2862138/28-13. (22) 19.12.79 (46)07.О7.86. Бюл. Ф 25 (71) Всесоюзный научно-исследовательский биотехнический институт (72) А. В. Данилов, А. H. Данилина, .И. В. Александрова (53) 542.61:581.176(088.8) (56) Фролова Л. В., Шамина Л. В. Кинетика искусственно культивируемой. клеточной популяции бобов. Цитология, 1978, т. 20, 9 5, с. 551. (54)(57) СПОСОБ ПОДГОТОВКИ ПРОБЫ . КУЛЬТУРЫ РАСТИТЕЛЬНОЙ ТКАНИ К ЦИТОИЕТРИЧЕСКОМУ АНАЛИЗУ путем обработки пробы мацерирующим раствором с после! дующим окрашиванием.мацерата метилеио вым синим, отличающийся ,тем, что, с целью предотвращения повреждения клеток и повышения степени сохранения их жизнестойкости, исполь зуют мацерирующий раствор следующего состава, мас. Х:

Кальций хлористый 1,95-2,05

Пектиназа Г10Х 2,45-2,55

Целлокандин ГЗХ 4,95-5,05

Вода дистиллированная Остальное причем обработку пробы мацерирующим раствором ведут при температуре

26+1 С в течение 4-5 ч при объемном соотношении пробы и мацерирующего раствора 1:1. 9

999595

Изобретение относится к области технологии выращивания пересадочных культур растительных тканей, используемых в качестве продуцентов биологически активных веществ в различных 5 отраслях промьппленности. пищевой, парфюмерной, медицинской, в частности к способам подготовки проб к цитометрическому анализу.

Под цитометрическим анализом куль- 1О

1 тур растительных тканей обычно понимают: подсчет числа клеток или плотности клеток в суспензии,.полученных в .результате мацерации ткани; 15 подсчет живых и мертвых клеток в результате витального окрашивания ткани; приготовление микропрепаратов для определения размеров клеток.

Все перечисленные составляющие цитометрического способа альтернативны.

Наиболее близким по технической оснащенности является способ подготовки пробы культур растительной ткани к цитометрическому анализу, включающий обработку пробы мацерирующим раствором — 207.-ным раствором хромоО вой кислоты при 60 С в течение 1520 мин (соотношение ткани и мацерирующего раствора I:3) для определения плотности клеток.

Подготовленную пробу подвергают цитометрическому исследованию. 35

В камере Фукса-Розенталя подсчитывают среднее (иэ шести повторностей) число клеток в 1 мл. суспенэии.

Затем вычисляют среднее число клеток на 1 мг сырого веса ткани и на всю 40 ткань в пробирке.

Жизнеспособность клеток оценивают по прижизненному окрашиванию пробы метиленовым синим (0,01%), приготовленным на растворе макросолей. Определяют среднее значение иэ трех повторностей (в сумме не менее 1000 клеток).

Для измерения размера клеток готовят давленые или резаные микропрепараты, их окрашивают ацетоорсеином или реактивом Шиффа.

Наиболее существенными недостатками известного способа являются: жесткие условия мацерации, приводящие к тому, что часть клеток полностью разрушается или деформируется, последнее ведет к значительной ошибке при подсчете числа клеток и делает невозможной точную оценку жизнеспособности и размеров клеток; некоторое количество клеточных агрегатов остается неразмацерированным, что также затрудняет точный подсчет числа клеток; субъективность .оценки живой и мертвой клетки.

Таким образом, из-эа жесткого, недостаточно избирательного эффекта воздействия на ткани, подвергаемые цитометрическому анализу, последний характеризуется значительными ошибками в определении, а также определенной сложностью, так как он фактически состоит иэ трех отдельных операций.

Определение жизнеспособности, числа и размера клеток требует применения различных, взаимоисключающих друг друга методов, для которых необходимо использовать различные пробы.

Целью изобретения является обеспечение более щадящего и мягкого воздействия на клетки исследуемой ткани, т.е. предотвращение повреждения клеток и повышение степени сохранения их жизнеспособности, в результате чего повышается степень точности определений при цитометрическом анализе и упрощается проведение анализа.

Указанная цель достигается описываемым способом подготовки пробы культуры растительной ткани к цитометрическому анализу, заключающемся в обработке пробы мацерирующим раст- вором с последующим окрашнванием мацерата метиленовым синим, причем используют мацерирующий раствор следующего сотава, мас. Е:

Кальций хлористый 1,95-2,05

Пектинаэа Г10Х 2,45-2,55

Целлокандин ГЗХ 4,95-5,05

Вода дистиллированная Остальное а обработку пробы мацерирующим раствором ведут при 26 1 С в течение 45 ч при объемном соотношении пробы и мацерирующего раствора 1:1.

Способ обычно осуществляют следующим образом.

Исследуемую культурную жидкость соединяют в равных количествах с мацерирующим раствором. Инкубацию проводят при 26 С в течение 4 ч на качалке. После обработки суспензия состоит преимущественно иэ одиночных

999595

15 сферических протопластов клеток, из небольшего числа мелких (не более

2-10 клеток) агрегатов, где можно легко проанализировать все клетки, а также из некоторого количества бес- 5 форменных мертвых клеток.

Перед анализом материала в мацерирующую жидкость добавляют метиленовой синий так, чтобы концентрация

его составляла 0,01%. 10

Анализируемую суспензию помещают в гемоцитометр Фукса-Розенталя и одновременно подсчитывают жизнеспособность кдеток, их число (плотность суспензии) и размеры.

Описываемый способ опробован на культурах тканей корня женьшеня, листа родиолы розовой и листа лука репчатого.

Пример 1. Цитометрический 20 анализ культуры ткани по известному способу.

Цитометрический анализ культуры ткани включает ряд отдельных анализов. 25

Мацерация ткани для подсчета числа клеток (определение плотности суспенэии).

Готовят раствор хромовой кислоты в концентрации 20Х. 30

В пробирку помещают 100 мг кал- лусной ткани и добавляют 20Х-ную хромовую кислоту в объеме 1:3.

Мацерат помещают в термостат при температуре 60 С на 15-20 мин.

Вынув пробирку из термостата, ее несколько раз энергично встряхивают . и содержимое перемешивают стеклянной палочкой.

Дпя определения плотности суспен- 40 зии 1 мл размацерированного материала помещают в гемоцитометр Фукса-Розенталя.

Под микроскопом просчитывают количество клеток. 45

Плотность расчитывают по формуле

1ООО.у х= — — — —, 3,2 где х — плотность суспензии; у — среднее число клеток на ка- 50 меру из 6 повторностей;

3,2 — объем камеры.

Определение живых и мертвых клеток. Определение жизнеспособности клеток проводят, применяя витальные красители.

Краситель митиленовый синий готовят в конпентрации 0,01% †но раство а, в качестве растворителя используют раствор макроэлементов .той среды, на которой выращивают культуру.

Используемую суспензию клеток помещают в раствор красителя на 5 мин.

Окрашенную суспенэию помещают на предметное стекло и просчитывают под микроскопом количество живых клеток (анализируют не менее 1000 клеток).

Определяют из них процент живых клеток.

В клеточных агрегатах определяют жизнеспособность.

Определение размера клеток.

Пробу ткани фиксируют. в смеси абсолютный спирт: уксусная кислота (3:1)

Проводят гидролиз 0,1 н. НС1 при о температуре 60 С в течение 10 мин и окрашивают по Фельгену, Готовят давленые препараты и окрашивают ацетоорсеином.

Препарат закрывают покровньпк стеклом, материал слегка давят.

Под микроскопом измеряют два диаметра клеток.

Площадь клетки определяют перемножением большого и меньшего диаметра.

Пример 2. Цитометрический анализ культуры ткани женьшеня по описываемому способу.

Готовят мацерирующий раствор следующего состава, мас. %:

Хлористый кальций 2

Целлокандин Г-3х С4-170

С>, †6 (Рассказовский

БХЗ) 5

Пектиназа Г-10х 70 ед. (Вышневолочский завод ферментных препаратов) 2,5

Дистиллированная вода рН 5,0-6,0 Остальное

Смешивают 1 мл исследуемой культуры с мацерирующим раствором в равных объемах.

Перемешивают в течение 1-2 мин для обеспечения лучшего контакта клеточной поверхности с ферментами.

Пробу инкубируют в течение 4 ч при 26 С на качалке.

Добавляют 0,1%-ный метиленовый синий в мацерат так, чтобы концентрация краски была 0,01Х, Помещают полученный мацерат в гемоцитометр Фукса-Розенталя для опрецеления жизнеспособности, количества. и размера клеток.

Кальций

„! хлорис-!

Пекти- Целло1 наза кандин! тый

88,2

0 5

0 5

1,0

2,5

0,5

87,3

5,0

3,4

93,2

4,0

2,0

28,0

l,0

2,5

5,0

98,1

26,9

I,0

43,9

2,0

1,0

2,0

84,5

2,0

52,3

2,0

3,0

24,1

3,0

94,6

2,0

3,0

88,3

4,0

82,7

2,0

87,1

100, 0

2,5

5 0

2,0

36,1

100,0

6,0

2,5

2,0

41,2

96,4

5 0

3,0

2,0

86,7

2,0

0,0

2,5

2,0

3,0

33,9

100,0

5,0

2,5 х Нормальная жизнеспособность культуры находится в пределах 70-907..

5 999595 б

Определение жизнеспособности про- На чертеже изображены формы изме водят путем раздельного подсчета жи" ряемых клеток, получаемых известным вых неокрашенных клеток сферической (а) и предлагаемым (б) способами. формы и мертвых бесформенных, окра- Таким образом, описываемый способ шенных метиленовым синим клеток. позволяет

Таким образом, в анализе исполь- получать полностью размацерированзуются два четко регистрируемых пара- ную ткань и проводить точный подсчет метра: форма клеток и их окраска, числа клеток; что обеспечивает его надежность. одновременно с мацерацией витальКоличество клеток определяют, сум- 1п но окрашивать клетки для определения мируя живые и мертвые клетки (см. жизнеспособности, используя при этом табл. 1, 2, 3). два четко регистрируемых параметра, Размер клеток проводят, измеряя форму клеток и их окраску; диаметр протопласта, расчет ведут по проводить весь анализ на одной формуле объема шара: пробе, полученные данные характери3 зуют параметры живых клеток в абсоч= - п н лютных значениях.

Таблица 1

Влияние концентрации и соотнощения компонентов мацерирующей смеси на жизнеспособность и выход отдельныхклеток (культура ткани женьшеня)

Концентрация компонен- Выход кле" Жизнеспо1 тов, мас. % ток, 7 собность, Ж

999595

Т аблица 2

Статистический анализ данных, полученных известным и описываемым способами по определению жизнеспособности клеток (культура ткани женьшеню) Предлагаемйй способ (выборка л 10}

Известный способ (выборка п =100) Окончательный результат окончательный результат

Ж жизнеспособности

Ж жизнеспособ- t> ности

73, 1.

72,8

20.76,8

77,2

x=75,25

G=2,78

75,7

7 х=75,20

4 =55,66

76,1

Р30,95

75,9

9 РЗ0,95

75,4

74,2

75,3

90

100 группировка результатов конкретных измерений, n-=100

Результаты конкретных измерений

n=10 в группировке не нуждается

999595

Таблица 3

Статистический анализ данных, полученных известным и описываемым способами по определению количества клеток (культура ткани женьшеня) Известный способ, выборка и 1О

Предлагаемый способ, выборка и 10 окончательный результат результаты результаты окончательный результат конкретных из мерений конкретных из

f, мерений

Данные по количеству клеток х10

294

274

270

214

270

237

268

214 х=259,8

147 111,42 х=270,74

271

6 2,97

Ф0,95

272

270

328 Р=,0,95

271

330

271

260

270

220

Редактор П. Горькова Техред М.Моргентал Корректор M. Демчик

Заказ 3725/1 Тираж 490 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4