Способ количественного определения замещенных цефалоспоринов

 

СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЗАМЕЩЕННЫХ ЦЕФАЛОСПОРИНОВ путем хроматографирования анализируемого вещества на анионообменной смоле, элюирования с использованием буферного раствора с последующим фотометрированием элюата, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности, точности способа и расширения области его применения, в качестве анионообменной смолы используют смо .лу с ра змером части-ц 5-25 мкм, емкостью 3-5 мг-экв/г в качестве элюемта используют фосфатный или ацетатный буферной раствор с рН 5-8, содержащий 5-20.О6.% этанола, и элюирова- g ние ведут со скоростью 10-40 мл/ч. (Л 4i 00 4

„„SU„„10484 01 A

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

3(5п G 01 N 31 08

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И OTHPblTHA

Г

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 3442416/23-04 (22) 21.05.82 (46) 15.10.83. Бюл. В .38 (72) A.M.Áëèíêoâcêèé, .В.-Ю.К.Швядас, С.Н.Бубенщикова, В.К.Каграманова, Л.A.Áàðàòoâà, Ю.З.Бартошевич и A. Г. Домрачева ,(71) Ордена Ленина, ордена Октябрьс. кой Революции и ордена Трудового

Красного Знамени московский государственный университет им.М.В.Ломоносова и Всесоюзный научно-исследовательский институт антибиотиков (53) 543.54.45(088,8) (56). 1..М.Fake .,Н, R.Felix,Е.Von.Arx

Fast and simple method for the separation of intermediates and соКЙсtors invoEded in the biosyntnesis о. Г cephalospor I n С ив1ищ chemica fly Ьопйес С 2 reversedphase thin-layer

;chromatography.I.÷:hromàtogr.,193,, 1980, р.511-514. Ъ

2. С.I.Budd, A поче R Ойп fayer

chromatographic system and its

application to the separation of

some cephatosporin compounds. Е.

Chromatogr., 76, 1973, р.509-511 (прототип). (54) (57) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО

ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЗАМЕЩЕННЬФ ЦЕФАЛОСПОРИНОВ путем хроматографирования анализируемого вещества.на анионообменной смоле, элюирования с использованием буферного раствора с последукщим фотометрированием элюата, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности, точности способа и расширения области его применения, в качестве анионообменной смолы используют смолу с pasMepoM частиц 5-25 мкм, ем-. костью 3-5 мг- экв/r,â качестве элюента используют фосфатный или ацетатный буферный раствор с рН 5-8, содержа" щий 5-20,"об.В этанола, и элюирова- g, ние ведут со скоростью 10-40 мл/ч.

CO

«Вь

«В»

}048401

Изобретение относится к аналитической химии, а именно к способам определения. природных цефалоспоринов и их ядер - 7-аминоцефалоспорановых кислот, и может быть использовано в лабораториях микробиологической и медицинской промышленностях прк производстве Р-лактамных анти биотиков цефалоспоринового ряда.

Цефалоспорин С и 7-аминоцефалоспорановые кислоты представляют собой 3,7-замешенные- а -цефем-4-карбо3 новые кислоты следующей структурной формулы где в случае цефалоспоринов Г в,=со(сн,), ск-соок; (БН

Й =ОСОСн, ОН, H а в случае 7-аминоцефалоспорановых кислот 2=0 осн, Он, Н .

Известен способ определения цефалоспоринов тонкослойной хроматогра- . фией на пластинах фирмы Antec (Швей-) цария) с химически связанной фазой

OPT} и РС., с последующим элюированием смесью воды с диоксаном, взятых н объемном соотношении 98:2 с последующей обработкой элюата нингидрином и его .фотометрированием }1j, Недостатком способа является малая чувствительность и невозможность определения 7-аминоцефалоспорановых кислот.

Известен способ определения 7-аминоцефалоспорановых кислот тонкослойной хроматографией на пластинах

Merch з1 }са Ge8 F 2 4 элюированием

0,5 M водным раствором хлористого натрия с последующим фотометрированием элюата при 254 нм.

Однако данный способ характеризуется невысокой точностью и невоз- можностью определения цефалоспоринов С.

Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемым результатам является способ количественного определения цефалоспоринов С путем жидкостной хроматографии на анионообменной смоле

SAX-ZIPAX фирмы Du pont с частицами размером 25-37 мкм, емкостью

12 мкг-экв/г с последующим элюированием. боратным буферным раствором.с рН 9,6 при скорости элюирования

27 мл/ч при комнатной температуре с последующим спектрофотометрированием элюата при 254 нм } 23.

Недостатком способа является малая чувствительность (2 10 4M), невысокая точность (близкие времена удерживания цефалоспорина С и дезацетилцефалоспорина С) и невозможность определения 7-аминоцефалоспора. новых кислот, т.е. ограниченяая область применения, 10 Цель изобретения повышение точности, чувствительности способа и расширение области его применения.

Йель достигается тем, что согласно способу количественного определе-

35 ния замещенных цефалоспоринов путем хроматографирования анализируемого вещества на анионообменной смоле, элюирования с использованием буферного раствора с последующим фотомет20 рированием элюата в качестве анионообменной смолы используют смолу с размером частиц 5-25 мкм,. емкостью

3-5 мг-экв/л, в качестве элюента используют фосфатный или ацетатный буферный. раствор с рН 5-8, содержащий 5-20 об.Ъ этанола, и элюирование ведут со скоростью 10-4.0 мл/ч..

При работе со смолой, диаметр частиц которой меньше 5 мкм, для

1цостижения рабочей скорости элюации

ЗО (10 мл/ч и более) требуется значительное увеличение давления в колонке.: что приводит к быстрой потере прони цаемости колонки и сокращает срок ее эксплуатации. Уменьшение,же скоЗ5 рости элюации нежелательно, поскольку увеличивается продолжительность анализа (до 5 ч и более). Использование в качестве стационарной фазы частиц диаметром более

4Q 25 мкм значительно ухудшает качество разделения.

Применение анионообменной смолы с емкостью меньшей чем 3 мг-экв/г затрудняет анализ многокомпонентных

45 систем, вызывает необходимость разбавлять анализируемые пробы, что сказывается на точности определения.

Если емкость смолы более 5 мг-экв/г, то наблюдается сильная сорбция компонентов на носителе. Это . в свою очередь требует. элюента более концентрированного, чем 0,5 M.

При использовании в качестве элю. ента растворов с концентрацией соли менее 0,1 М происходит увеличение времени.удерживания соединений на колонке, что удлиняет процесс разделения до, 6 ч и более. Использование концентрации выше 0,5 М невоз-. можно из-за выпадения в осадок крис6() таллов соли в присутствии этанола.

Применение элюентов с рН меньше 5 нежелательно вследствие уменьшения сорбцки компонентов анализируемой смеси. Проведение элюацик при рН

65 больше 8 осложняет процесс анализа

1048401

65 из-за частичной деструкции определя. емых вещестн.

Увеличение содержания этанола выше 20% делает невозможным разделение цефалоспорина С и 7-амино-3-дезацетилцефалоспораноной кислоты, а также приводит к набуханию частиц сорбента и потере проницаемости ко« лонки. Если концентрация этанола ниже 5%, то отсутствует элюация компонентов сорбента.

Проведение разделения.при малых. (менее 10 мл/ч) скоростях элюации увеличинает продолжительность анализа и приводит к размыканию зон сорбции, что понижает чувствительность и точность метода. Элюирова" ние при скоростях потока более

40 мл/ч ухудшает разрешение соедине." ний, имеющих небольшое различие времен удержания, а также приводит к спрессонанию частиц анионообменной смолы и делает колонку непроницаемой. Компоненты смеси (дезацетокси цефалоспорин С, дезацетилцефалоспорин С, цефалоспорин С, 7-амино-3дезацетоксицефалоспорановую кислоту, 7-амино-3-дезацетилцефалоспорановую кислоту и 7-аминоцефалоспорановую кислоту) детектируют по их поглоще-. нию при длине волны 254 нм. Идентификацию индивидуальных компонентов смеси производят путем сравнения неличин времени их удерживания на ко1 лонке с соответстнукщей характерис-. тикой стандартных образцов. Количество (или концентрации) соедине.". ний в анализируемой смеси определяют путем построения соотнетстнунзцих калибровочных кривых.

Для построения калибровочных кривых аликноты стандартных растворов индивидуальных веществ хроматографируют и определяют площади пиков на хроматограмме по формуле

S = Н

2 где S — - площадь пика;

Н вЂ” высота пика;

W — — ширина пика на половине вы2 соты.

Беличину калибровочного коэффициента в области линейности калибровочной кривой определяют по формуле

К = —, где К вЂ” калибровочный коэффициенту с — концентрация компонента в N (или мг/мл).

Пример 1. 5 мкл раствора; содержащего смесь цефалоспорина С (ЦПС), дезацетилцефалоспорина С (ДАЦПС)., дезацетоксицефалоспорина С (ДОЦПС), 7-аминоцефалоспорановой кислоты (7-АЦК), 7-амино-3-дезацетилцефалоспорановой кислоты (7-АДАЦК) и

7-амино-3-дезацетоксицефалоспорановой кислоты (7-АДЦК) наносят на колоьку

250х 2, 2 мм жидкостного хроматогра- фа фирмы Varian, термостатированную при 50 С, с анионообменной смолой о марки Hetache-2632 (Япония), имеющей емкость 3,2 мг-экв/г и размеры частиц 13,5+1,5 мкм, н Н РО4 форме и разделение осуществляют 0,25 М раствором Н Н РО, РН 7,0, содержащим 10% этайола. Скорость потока

10 20 мл/ч.

Детектирование осуществляют в проточной кювете с объемом 8 мкл при длине волны 254 нм.

Время удерживания, приготовлен15 ные по навеске концентрации и определенные из хроматограмм концентрации (М) компонентов в смеси сведены в табл.1-6.

Ошибка измерения +2%. Точность щ определения 98%.

П р и м e p 2. 5 мкл раствора, содержащего смесь ЦПС, ДАЦПС, ДОЦПС, 7-АЦК, 7-АДАЦК и 7-АДЦК наносят на термостатированную при. 50 С колонку

250х2,2 мм с анионообменной смолой марки Aminimex А-27 Duopam (США) емкостью 3,2 мг-экн/г и размерами частиц 5+1 мкм, и разделение проводят 0,25 М растнором (NH4)2HPO4 РН

8,0, содержащим 10% этанола прй скорости потока 40 мл/ч.

Точность определения 98%. Ошибка измерения «+ +2%.

Пример 3. 5 мкл раствора, содержащего смесьс шести компонентов, 35 наносят на ксжонку с анионообменной смолой марки ДА-Х8 (СНА) емкостью 3,2 мг-экв/г и размерами частиц

25+2 мкм. Разделение проводят в ус,ловиях, описанных в примере 1, за

40 исключением того, что в качестве подвижной фазы используется СН COONH

РН 5,0.

3 .4

Ошибка измерения +4%. Точность определения 96%.

45 П Р и м е р,4. 5 мкл кулвтуральной жидкости Chephatosporium acremonium с неизвестным содержанием цефалоспорина, предварительно отфильтрованной от питательной среды и клеток, наносят на колонку с анионообменной смо-50 лой марки DOUX 1к8 .(ФРГ) с размерами

1 частиц 13,5+1,5 мкм и емкостью

5 мг-экн/г. Разделение проводят в условиях, описанных н примере 1.

Пример 5. Образец в объеме

55 5 мкл, приготовленный, как указано в примере 4, наносят на колонку с аиионообменной смолой емкостью

3,2 мг-экв/г.с размерами частиц

13,5+1,5 мкм, и разделение проводят

60,РаствоРом 0,1 М Н4Н2РО4 РН 7,0, содержащим 50% этанола, в условиях, описанных в примере 1.

Пример 6. Образец в объеме

5 мкл, приготовленный как указано в прймере 4, наносят на колонку с

1048401

- Таким образом, предлагаемый-способ позволяет определить 6 веществ, 4! Таблица 1

° °

Компоненты . ДАЦПС ДОЦПС

ЦПС 7-АДАЦК 7-АДЦК 7-АЦК

Время удержания, IMPfH

15,5 24,5

10 5

8,5

3-1О-< г 1О- 2 10 5 1О- 2 10- 5-1О-

Концентрация по навеске, М

Концентрация оп, ределенная, И 3,06 10 2 .10,2,03 10 4,92, 10 1,97 ° 10 ® 4,9.10

Т аблица 2

ДАЦПС . ДОЦПС ЦПС 7-йДАЦК 7-АДЦК 7-АЦК

Компоненты

Время удерживания„ мин . :, 3

14,5

4,3

;8,8 6,6

Концентрация .по навеске,моль/л 1 01 4

5 .10 6 8 -10-6 2-10 6 4 10- 5 1О-6

Концентрация определенная моль/л

Оу99.16;4 4,9 ° 10" .8,1 10 1,96 16 4,1 10 5,-1 10

Таблица 3

Компоненты ДАЦПС ДОЦПС ЦПС

7 АДАЦК 7-АДЦК 7-Mg(Ф Ю 4» ю

Время удержива» ния, мин

4,1

7,2

4,9

10, 5

Коцентрация по навеске, М

l "10 4 8 106 1 10 + 1 10 4 - 6 .10

2 10-Ч .

ЮЮФ ЮВ ° Ю Ю ЮЮЬ В

Концентрация определенная,М

l,04 ° 10 7,97«10 9) 81664 0,96 10 S,8610 2,07 ° 16 анионообменной смолой емкостью

3,2 мг-экв/г. с размерами частиц

13,5+1,5 мкм, и-разделение проводят растворо м О .5 М ян1 Н2РОФ. рН 7.0, содержащим 20% этанола,,в условиях, описанных в примере 1.. содержащих ядра цефалоспоринов в многокомпонентных и реальных объектах (на 3 вещества больше, чем по прототипу). Точность определения.

96-98%, чувствительность определе5 ния 10 > М, т.е. на порядок выше, чем по прототипу. При этом продолжительность анализа составляет 625 мин.

1048401

Таблица 4 цпс

ДОЦПС

ДЛЦПС

Компоненты

10,6

8,3

6,2

Коцентрация определенная, М

2,9-10 4

4,95 10 4

1,5 ° 10

Таблица5

ДОЦПС

ЦПС

Д)ЩПС

Компоненты

Время удерживания мин

14,5

20,5

Таблица 6

ЦПС

ДОЦПС

ДАЦПС

Компоненты

Время удерживания мин

2,6

2,1

1,5

5 104

3 ° 2 ° 10 3

1,6 ° 10-2

Из-за близких значений. времен удерживания ошибка при определении концентрации дезацетоксицефалоспорина (ДОЦПС) может быть значительной1 как следствие — 20% этаиола в элюенте.

ВНИИПИ Заказ 7924/51 Тираж 873 Подписное

Филиал ППП "Патент",г.ужгород,ул.Проектная,4

Время удерживания, мин

Концентрация оп(ределенная, М

Концентрация определенйая, И .

4,1 10- З 3,9 10 4 14,2 ° 10