Способ определения стероидных сапонинов и сапогенинов

 

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТЕРОИДНЫХ САПОНИНОВ И САПОГЕНИНОВ путем тон1 ослойного хроматографирования раствора анализируемого вещества Р пбСАедугощей обработкой силикагеля при нагревании в присутствии хлороформа цветореагвнтом, содержащим концентрированную серную кислоту , и фотометрирование полученного раствора, отличающий с я тем, что, с целью повышения точности способа, в качестве цветог| реагента используют смесь уксусного ангидрида и концентрированной серной кислоты, взятых в объемном соотношении 9:1, и обработку ведут при е 35-40°С.f (Л

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

)(5H G 01 N 31/08

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ABTOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕНКИЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3427112/23-04 (22) 22.04.82 (46) 23.09.83. Бюл. М 35 (72) Ц.П.Сулаквелидзе, Э.П.Кемерте лидзе и М.Г.Чирикашкили (71) Институт фармакохимии им. И.Г.Кутателадзе (53) 543. 54.42 (088.8) (56) 1. Пасешниченко В.A.. и др.

Фотометрический метод определения свободного и глюкозидносвязанного диосгенина в корневищах диоскореи дельтовидной. » Прикладная биохимия и микробиология, уШ, 92, 1972.

2. И. ЕИпа1п Wojtaszek-. Hosciowe . oznacrania d1gitonkny u nasionach

naparstnicy purpurowy. "Herba po()on", 1975, 21, 4, 377-384 (прототип) °

„„SU„„1043560 А (54) (57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТЕРОИДНЫХ САПОНИНОВ И САПОГЕНИНОВ путем тонкослойного мроматографировани я раствора акали виру емого в еще с-.. в а р по(жЕдующей обработкой силикагеля при нагревании в присутствии хлороформа цветореагентом, содераащим концентрированную серную кис.лоту, и фотометрирование полученного раствора, о т л и ч а ю щ и й— с я тем, что, с целью повышения точности способа, в качестве цвето реагента используют смесь уксусного ангидрида и концентрированной серной кислоты, взятых в объемнвм со.отношении 9:1, и обработку ведут при

35-40©С. Ф

1043560

Т а б л и ц а 1 ((Г, f) dx

f x

Изобретение относится к аналитической химии природных органических соединений, преимущественно к способу количественного определения стероидных сапонинов и сапогенинов.

Известен способ определения сте- 5 роидных сапонинов и сапогенинов путем экстракции из растительного сь рья, распределительном хроматографировании, получении пятна исследуемого вещества, обработки его нагреванием при 60 С со смесью конценто рированной серной кислоты и водного формальдегида в течение 15 мин с последующим фотометрическим определением t1 ).

Недостатком этого способа является то, что сапонины и сапогенины при нагревании со смесью концентрирован4 1,11 0,00925 0,043 0,95

Однако сапонины и сапогенины при нагревании с концентрированной сер- Зр ной кислотой не дают устойчивой во времени окраски, что приводит к относительно невысокой точности.

Целью изобретения является повышение точности способа. 35

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу определения стероидных сапонинов и сапогенинов путем тонкослойного хроматографирования раствора анализируемого вещест- 4р ва с последующей обработкой силикагеля при нагревании в присутствии хлороформа цветореагентом, содержащим концентрированную серную кислоту, и фотометрированием полученного раствора. В качестве цветореагента используют смесь уксусного ангидрида и концентрированной серной кислоты, взятых в объемном соотношении

9:1, и обработку ведут при 35-45 С.

Пример 1. Определение дигитонияа в семенах наперстянки красной.

2 r (с точностью до 0,01 г) семян наперстянки красной, измельченных в просеянных сквозь сито с диамет- -55 ром отверстий 0,25 мм, обезжиривают в аппарате Сокслета экстракцией петролейным эфиром в количестве 20 мл в течение 12 ч. Обезжиренные семена высушивают на воздухе, 6Р помещают в колбу вместимостью 100 мл, заливают 60 мл 70%-ного этилового спирта, закрывают колбу пробкой, взвешивают (с точностью до 0,01 г) и выдерживают 1 ч, Затем содер- 65 ной серной кислоты и водного формальдегида не дают устойчивой во времени окраски, что приводит к невысокой точности способа.

Наиболее близким к изобретению по технической сущности и достигаемым результатам является способ определения стероидных сапонинов и сапогенинов путем тонкослойного хроматографирования раствора анализируемого вещества, обработки силикагеля цветореагентом — концентрированной серной кислотой в присутствии хлороформа при 60 С и фотометрированием полученного раствора (2).

Метрологическая характеристика известного метода количественного определения дигитонина приведена в табл.1.

2,77 0,16128 0,11911 — + 10,7 жимое колбы соединяют с обратным холодильником, нагревают до кипения и поддерживают слабое кипение жидкости в течение 2 ч. По охлаждении колбу с содержимым вновь закрывают пробкой, взвешивают и убыль в весе пополняют 70Ъ-ным этанолом.

Жидкость тщательно взбалтывают, фильтруют через сухой фильтр в сухую круглодонную колбу и отгоня ют под вакуумом на ротационном испарителе досуха. Остаток растворяют в смеси хлороформ-этанол (1:1), переносят в колбу емкостью 25 мл и объем доводят тем же растворителем до метки (раствор А).

Хроматографирование. Пластинку с силикагелем размером 14 20 см делят на три равные части, обозначенные номерами 1 — 3. 0,25 г (точная навеска) высушенного дигитонина при 105 помещают в мерную колбу емкостью 25 мл, доводят до метки систе1 мой хлороформ-метанол-вода (65:35:10) — раствор Б. На первую и вторую полоски наносят 0,2 мл раствора й, на третью полоску 0,2 мл раствора Б. Пластинку высушивают на воздухе, после чего хроматографируют в системе хлороформ-метанолвода (65:35:10) до поднятия фронта растворителей на 18 см. После этого пластинку выдерживают в сушильном шкафу при 80 в течение

5 мин и рассматривают в УФ-свете.

На уровне проявленного пятна стандартного дигитонина обводят участки на полосках 1 и 2. С отмеченных

l043560

V — количество сгущенного спир2 тового извлечения, нанесенного на пластинку для хроматографирования, мл;

V — объем окрашенного раст3

5 вора, мл;

С, — концентрация раствора стандартного образца дигитонина;

Π— оптическая плотность раствора стандартного образца

<0 дигигитонина;

b — потеря в весе при высушивании;

D оптическая плотность исследуемого раствора.

)5 Содержание дигитонина в семенах наперстянки красной 3,7%. Метрологическая характеристика метода количественногo определения дигитонина в семенах наперстянки красной приве20 дена в табл.2.

Таблица 2 г 4. f

P t(р,f) Ьх

9 3,98 .О,бi01 +0,1005 95 2,26 +0,2271 +5,7

+3,29

Пример 2. Определение тигогенина в кюке славной.

2 r измельченных листьев юкки славной, просеянной сквозь сито с диаметром отверстий 0,1 мм, помещают в колбу емкостью 100 мл, заливают 42 мл 503-ного этилового спирта, взбалтывают и нагревают в течение

20 мин на кипящей водяной бане с обратным холодильником, Затем до- 40

,бавляют 8 мл концентрированной НС0 и нагревают в течение 3 ч. Массу после нейтрализации 10%-ным NaOH помещают в делительную воронку емкостью 50 мл и извлекают 7 раз по : 45

15 мл хлороформом. Хлороформные из влечения переносят в круглодонную колбу вместимостью 20 мл и отгоняют под вакуумом на ротационном испари теЛе досуха. Остаток растворяют в хлороформе, переносят в колбу емкостью 25 мл и объем доводят тем же растворителем до метки (раствор A).

Пластинку с силикагелем размером 14 ° 20 см делят на три равные части, обозначенные номерами 1-3..

0,25 r (точная навеска) высушенного,тигогенина при 105О помещают в мерную колбу 25 мл и доводят до метки. хлороформом (раствор Б). На первую и вторую полоску наносят 60

0,2 мл раствора 2, на третью полоску 0,2 мл раствора Б. Пластинку высушивают на воздухе, после чего хроматографируют в системе хлороформ-этанол (24:1) до поднятия фрон- 65 участков по отдельности выскабливают силикагель, переносят в колбы емкостью 25 мл, добавляют по 7 мл смеси уксусного ангидрида с серной кислотой (9:1) и в ультратермостате выдерживают в течение 30 мин при 40 С, Объем жидкости в мерных колбах доводят до метки хлороформом. Измеряют оптическую плотность фильтратов на фотоколориметре ФЭК-56 с использованием светофильтра Р 3 (7l= 400+5) в кюветах толщиной слоя

10 см. Содержание дигитонина вычисляется по формуле

C cx VV g

)Зст V2 а (100-b) где а - навеска сырья, г;

V< — объем сгущенного спиртового извлечения, мл; та растворителей на 18 см. Пластинку выдерживают в сушильном шкафу при

80 в течение 5 мин и рассматривают в УФ-свете. На уровне проявленного пятна стандартного тигогенина обводят участки на полосках 1-2. С отмеченных участков по отдельности выскабливают силикагель, переносят в колбы емкостью 25 мл, добавляют по 7 мл смеси уксусного ангидрида с серной кислотой (9:1) и в ультра-. термостате выдерживают в течение

30 мин при 40О . Объем жидкости в мерных колбах доводят до метки хлороформом, Измеряют оптическую плот ность фильтратов на фотоколориметре

ФЭК-5б с использованием светофильтра 9 3 (Л= 400+5) в кюветах толщиной слоя 10 мм. Содержание тигогенина вычисляют по формуле (1).

Пример 3. Количественное ,определение дигитонина в готовом продукте.

0,25 r (точная навеска) дигитонина помещают в 25 мл мерную колбу, растворяют в смеси хлороформ-метанол (1:1) и объем доводят тем же растворителем до метки (раствор А).

Приготовление стандартного раствора дигитонина (раствор Б). 0,25 r (точная навеска) высушенного дигитонина при 105 помещают в 25 мл мерную колбу, растворяют в смеси хлороформ-метанол (1:1) и объем до водят тем же растворителем до метки.

1043560

D б 100 100

С

X D с ° а(100-b) 35

Таким образом, предлагаемый спо" соб позволяет повысить точность оп, ределения стероидных сапонинов и сапогенинов. Относительная ошибка анализа уменьшается с + 10,7 до 5,7%.

Тираж 873 Подписнее

Ужгород, ул, Проектная, ПЛастинку с силикагелем размером

14 20 см делят на три равные части.

На первую и вторую полоски наносят 0,2 мл раствора й, на третью полоску 0,2 мл раствора Б.

Пластинки .высушивают на воздухе, после чего хроматографируют в сис, теме хлороформ-метанол-вода (б5:35:10) до поднятия фронта растворителей на. 18 см. Пластинки выдерживают в.сушильном шкафу при 80 С в 10

;:течение 5 мин. Пластинку рассматри1вают в УФ-свете. На уровне проявления пятна стандартного дигитонина обводят участки на полосках 1 и 2.

С выделенных участков по отдельности снимают силикагель, переносят в колбы емкостью 25 мл, добавляют по 7 мл смеси уксусного ангидрида с серной кислотой (9:1), помещают в ультратермостат и выдер- 7(1 живают в течение 30 мин при 40 . После этого добавляют по 10 мл хлороформа, фильтруют через бумажный фильтр в мерные колбы по 25 мл. Колбы неоднократно споласкивают 5 мп хло- 25 роформа и промывают фильтр. Объем жидкости в мерных колбах доводят до метки хлороформом. Измеряют оптическую плотность фильтратов на фотоколориметре ФЭК-56 с использованием светофильтра М 3 (Л= 400+5) в кюветах толщиной слоя 10 мм. Содержание дигитонина вычисляют по формуле где D — оптическая плотность испытуемого раствора;

D — оптическая плотность стано дартного раствора; а е навеска испытуемого дигитонина; б - навеска стандартного раствора дигитонина;

Ь вЂ” потеря в весе при высуши- 4с; вании.

Содержание дигитонина в препарате должно быть не менее 963 в пересчете на сухое вещество.

Пример 4. Способ определения тигогенина в готовом продукте.

0,25 r (точная навеска) тигогенина помещают в 25 мл мерную колбу, растворяют в хлороформе и объем доводят т ем же растворителем до метки (раствор A) .

Приготовление стандартного раствора тигогенина (раствор Б). 0,25 r (точная навеска) высушенного тигогенина при 105 помещают в 25 мл мерную колбу. Доводят объем до метки хлороформом.

Пластинку с силикагелем размером 10 20 см делят на три равные ВНИИПИ Заказ 7330/47

Филиал ППП Патент, г. части. Па первую и вторую полоски наносят 0,2 мл раствора A,на третью полоску 0,2 мл раствора Б.

Пластинки высушивают на воздухе, после чего хроматографируют в системе хлороформ-этанол (25:1) до поднятия фронта растворителей на

18 см. Пластинки выдерживают в сушильном шкафу при 80 в течение о

5 мин. Пластинку рассматривают в УФсвете. На уровне проявленного пятна стандартного тигогенина обводят участки на полосках 1 и 2. С выделенных участков по отдельности снимают силикагель, переносят в колбы емкостью 25 мл, добавляют по 7 мл смеси уксусного ангидрида с серной кислотой (9:1), помещают в ультратермостат и выдерживают в течение

30 мин при 40 . После этого добавляют по 10 мл хлороформа, фильтруют через бумажный фильтр в мерные колбы по 25 мл. Колбы неоднократно споласкивают 5 мл хлороформа и промывают фильтр. Объем жидкости в мерных колбах доводят до метки хлоро- формом. Измеряют оптическую плотность фильтратов на фотоколориметре

ФЭК-56 с использованием светофильтра Р 3 (h = 400 5), в кюветах толщиной слоя 10 мм. Содержание тиroгенина вычисляют по указанной формуле.

Содержание тигогенина в препарате должно быть не менее 80% в пересчете на сухое вещество.

Пример 5. При увеличении уксусного ангидрида в соотношении

10:1 с концентрированной серной кислотой нарушается стабильность окраски во времени, т.е. невозможно точное определение количественного содержания целевого продукта.

Пример 6. При уменьшении уксусного ангидрида в соотношении

8:1 с концентрированной серной кислотой нарушается стабильность окраски Во времени, т.е. невозможно точное определение количественного содержания целевого продукта.

Пример 7. При изменении оптимального времени с 30 мин на

20 мин наблюдается снижение стабильности окраски во времени в течение 12 ч.

Пример 8. При изменении оптимальной температуры с 40О на 25 С наблюДается снижение стабильности окраски в течение 24 ч.