Способ количественного определения дезоксирабонуклеиновых кислот в биологических жидкостях
СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО СП РЕДЕЛЕНИЯ ДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕИНОВЬК 0 w«e«tye, между .Сбободноа / .tin.otf : УНЛНК 4. Дв AS 2.0 /,2 0. КИСЛОТ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ путем обработки исследуемого образца раствором ДНК, меченой радиоизотопом , и сыровороткой крови, содержащей антитела к ДНК, с последующей инкубацией, осаждением йкч«1унного комплекса и определением ДНК, отличающийся тем, ITO, с целью Повышения чувствительности способа, перед инкубацией в реакционную смесь добавляют декстрансульфат в концентрации 13-16% и инкубацию осуществляют в течение 30 40 мин, а иммунные комплексы осаждают 3,5-5%-ным раствором полиэтиленгликоля в течение 1,5-2 ч. -х. ,
(191 (И)!
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК
ЗСЮ. 6 01 и 33 48:
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ
О а- а . СЮа ЯоаЪюи „ю сглаза.удару"
; HAHK
2, О
%айдик, НГ
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР
ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3406132/13 (22) 04.03.82 (46) 23.10.83 Бюл. В 39 (72) В.К.Подгородниченко, А.В.Конов,.
С.В.Лайко, Д.В.Корогодин . и A.М.Поверенный (71) Научно-исследовательский институт медицинской радиологии (53) 615.373.3 (088.8) (56) 1. йай1 Caucer lust; 1977,Ч; 58, В 5, р. 1205..
2 . J,.lmmunol Neth. и 9, 157, 1975 . (прототип). (54)(57) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОП=
РЕДЕЛЕНИЯ ДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕИНОВЦХ
КИСЛОТ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ЖИДКОСТЯХ путем обработки исследуемого образца раствором ДНК, меченой радио- изотопом, и сыровороткой кровя, содержащей антитела к ДНК, с последующей инкубацией, осаждением ИмМунного комплекса и определением ДНК, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности способа, перед инкубацией в реакционную смесь добавляют декстрансульфат в концентрации 13-16% и инкубацию осуществляют в течение 30—
40 мин, а иммунные комплексы осаж- дают 3,5-5%-ным раствором поли.этиленгликоля в течение 1,5-2 ч.
1 Ф
1049803
Изобретение относится к исследованию биологических материалов с иСпользованием радиоактивных меченых веществ, а именно к количественному определению ДНК, и может быть использовано в экспериментальных и лабораторно-клннических исследованиях для диагностики патологических состояний, сопровождаюцихся появлением ДНК в биологических жидкостях.
Известны способы определения ДНК в биологических жидкостях, основанные на преципитации исследуемой
ДНК антителами к нативной ДНК (fJ .
Однако этот способ обладает низкой чувствительностью и недоста точной специфичностью.
Известен также способ количественного определения ДНК в биологических жидкостях путем обработки исследуемого образца раствором ДНК, меченой радиоизотопом 1, и сы- i вороткой крови, содержащей антитела к нативной ДНК, с последуюцей инкубацией при 37 С в течение 1 ч и при
О
4 С в течение ночи, осаждением им0 мунных комплексов насыщенным раствором сульфата аммония при 4 С в течение 1 ч, определением радиоактивности в осадке и расчета коли; чества ДНК по калибровочной крови f2) .
Однако известный способ является сложным и дпительным при выполнении, а также недостаточно чувствительным.
Сложность обусловлена предваритель ным отбором сыровороток и использованием больших количеств меченого препарата " 1 дезоксиуридина с высокой удельной активностью. Чувствительность снижается вследствие диссоциации иммунных комплексов в полунасыщенном растворе сульфата аммония. Время определения составляет 18 ч.
Целью изобретения является повышение чувствительности способа.
Укаэанная цель достигается тем
I что при осуществлении способа требуется обработка исследуемого об разца раствором ДНК, меченым радиоизотопом, и сывороткой крови,. содержащей антитела к нативной ДНК, с последующей инкубацией,,осаждением иммунного комплекса и определением ДНК, перед инкубацией в реакционную смесь добавляют декстрансульфат в концентрации 13-16% и инкубацию осуществляют в течение
30-40 мин, а иммунные комплексы осаждают 3,5-5,0%-ным раствором полиэтиленгйиколя в течение 1,5—
2 ч.
Способ осуществляется следуюцим образом,.
Готовят реакционную смесь, состояцую из 20 мкл тестируемого образца, меченой радиоизотопом трития
ДНК с массой, соответствующей
2000 имп./мин в объеме 30 мкл и
1 мкл сыворотки больного системной красной волчанкой, содержащей антитела к нативной ДЙК. Осаждают белки, неспецифически реагирующие с ДНК, добавлением 20-25 мкг декстрансульфата в 20 мкл и общий объем смеси доводят до 150 мкл стандарт10 ным солевым раствором (0,15 М NaC1
0,015 М цитрат натрия, 0,003 М трисHC0), рН 8,0.Смесь инкубируют 30
40 мин при 37 С. Иммунные комплеко сы ос аждают в 3, 5-5%- ном растворе полиэтиленгликоля при 4аС в течение 1,5-2 ч. Полученный раствор центрифугируют в течение 30 мин при 3000 об;/мин и определяют радиоактивность надосадочной жидкости.
Количество ДНК определяют по калибровочной кривой, построенной аналогичным способом с известными количествами ДНК.
Пример. Проводят определение концентрации ДНК в сыворотках больных вирусным гепатитом. К 1 мкл сыворотки больного системной крас- ной волчанкой, содержащей антитела к нативной ДНК, добавляют 20 мкл тестируемой сыворотки, 20 мкг декстрансульфата в 20 мкл стандартного солевого раствора, 30 мкл меченой радиоизотопом 9Н ДНК 2000 имп/мин. (удельная активность 5 10 имп/мин) в этом же растворе. Обций объем реакционной
35 смеси доводят до 150 мкл стандартным солевым раствором (0,015 М цитрат натрия, 0,15 М хлорид натрия) с добавлением трис-НС8 буфера до конечной концентрации 0,003 M (рН
40 8,0) . Смесь инкубируют 30 мин при
37цС, добавляют равный объем 10%-ноpro полиэтиленгликоля в том же буфере, полученную смесь перемешивают и оставляют при 4 С в течение 2 ч. 3a.45 тем полученный раствор центрифугируют в течение 30 мин при 3000 об/мин ,и определяют радиоактивность надоса дочной жидкости в 150 мкл смеси, нанесенной на бумажный фильтр.
Количество ДНК в пробе определяют по калибровочной кривой, построенной следующим образом: готовят реакционную смесь, состояцую иэ 1 мкл сыворотки, содержащей антитела к нативной ДНК, 30 мкл Н ДНК,20 мкг
55 декстрансульфата, 20 мкл разведенной сыворотки человека 1г100 и различные количества нативной ДНК от
0,01 нг до 300 нг. Общий объем доводят до 150 мкл стандартным солевым
60 раствором с добавлением трис-НСС буфера до конечной концентрации
0,003 М (рн 8 0) . Смесь инкубируют
30 мин при 37 С, добавляют равный объем 10%-ного полиэтиленгликоля, перемешивают и оставляют при 4 С s
1049803
Составитель П.Бонарцев
Редактор Н.Бобкова Техред М.Костик Корректор А.Зимокосов
Заказ 8407/41 Тираж 873, Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и.открытий
113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5
Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 течение 2 ч. Осадок отделяют центрифугированием и определяют радиоактивность надосадочной жидкости. Ис-.
0ольэуя полученные значения радиоактивности свободной ДНК, строят кривую зависимости. процента связан- 5 ной.меченной радиоизотопом Н ДНК от количества тестируемой ДНК, внесенной в реакционную смесь (см.чертеж . повышением концентрации опре- !9 деляемой ДНК, отношение между свободным и связанным лигандом уменьшается. Минимальная определяемая концентрация ДНК 0,03 нг в пробе или
1,5 нг/мп, максимальная 2 нг в пробе или 250 нг/мл. Точка 4, полученная путем экстраполяции данных отношения свободного и связанного лиганда для определяемой концентрации . ДНК в сыворотке больного вирусным гепатитом соответствует 160 нг/мл сыворотки. Эффективность определения ДНК в присутствии декстрансульфата, определялась путем сопоставления калибровочных кривых, построенных аналогичным образом с добавлением декстрансульфата и без него.
Чувствительность метода определения ДНК в присутствии декстрансульфата (кривая 1.) 1,5 нг/мл, а без декстрансульфата (кривая 2) 50 нг/мл.
Таким образом, способ обеспечивает по сравнению с существующими упрощение метода за счет устранения предварительного отбора сыворотки, содержащей антитела к нативной ДНК; повышение чувствительности с 25—
30 нг до 1,5-3 нг в пробе и сокращение времени определения с 18 ч до
3 ч.
Устранение неспецифически реагирующих с ДНК белков при одновременном использовании нового осадителя дает воэможность испольэовать более широкий спектр антител. В результате удаления белков, неспецифически реагирующих с ДНК и конкурирующих с антителами за участки связывания, повышается чувствительность определения концентрации ДНК в биологических жидкостях.
