Способ разделения лимфоцитов периферической крови

 

Союз Советских

Социапистичесних

Республик

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ ()895439 (61) Дополнительное к авт. свид-ву—

{22)Заявлено 13 ° 07 ° 79 (21) 279"833/28-13 с присоединением заявки № 2795917/13 (23) Приоритет

Опубликовано 07 ° 01 ° 82 Бюллетень № 1

Дата опубликования описания 07. 01 (ь))М. Кл.

A 61 К 35/14

Гоеударствснный комитет по депви изобретений и открытий (53) УДК 615. 373.

3(088.8) Л. Н. Зинковская, А. Н. Бубнов, Н. М. Калинин

Т.А.Герасева и А.Н.Яковлев (72) Авторы изобретения.1

Tl: X1r «м;

Ленинградский ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательский институт гематологий и переливания крови (7I ) Заявитель (541 СПОСОБ РАЗДЕЛЕНИЯ ЛИИФОЦИТОВ

ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ

Изобретение относится к области медицины, а именно к иммунологии, и касается разделения лимфоцитов периферической крови, используемых для имуннизации с целью получения диагностических специфических анти-Т и анти-В сывороток, а также для изучения роли тканевых антигенов локуса

Ш.А - DR в иммунном ответе.

Известен способ разделения лимфоцитов периферической крови путем проведения реакции розеткообразования лимфоцитов с эритроцитами с последующим центрифугированием полученных розеток в градиенте плотности фиколл-верографин.

Недостатком известного способа является то, что используют дорогостоящий, дефицитный фермент, а также длительность постановки реакции по этой методике.

Целью изобретения является упрощение способа.

Цель достигается тем, что предлагаемый способ разделения лимфоцитов периферической крови осуществляют путем проведения реакции розеткообразования лимфоцитов с эритроцитами с последующим центрифугированием полученных розеток в градиенте плотности фиколл-верографин, перед проведением реакции розеткообразования один из компонентов реакции облучают уЛь"

l0 трафиолетовыми лучами при длине волны 250-260 нм в дозе 1,3-1,8-10 эрг/см

2 в течение 1-1,5 мин.

При этом облучению подвергают лим15 фоциты и эритроциты.

Способ осуществляют следующим образом.

Кровь берут методом пункции локтевой вены донора. Дефибринирование ее производят немедленно после взятия, перемешивания деревянной палочкой или встряхивания со стеклянными бусами в течение 10 мин. Для приготовления градиента плотности 9,67 граммов фи25

3 89543 колла растворяют в 12?,5 мл дистиллированной воды и смешивают с 20 мл

763-ного верографина. Удельный вес полученной смеси равен 1,0771,079 г/мл. Дефибринированную кровь смешивают с равным объемом раствора

Хенкса, тщательно перемешивают встряхиванием и осторожно по стенке про" бирки наслаивают на градиент плотности фиколл-верографин в соотношении !о

2: 1. Центрифугируют в рефрижераторной центрифуге при 600 g и + 4 С в течение 30 мин. Клетки, скопившиеся на границе раздела двух фаз и визуально определяемые в виде опалесцирую- !5 щего кольца, осторожно отсасывают с помощью пастеровской пипетки или шприца с длинной иглой. Клеточная взвесь представляет собой преимущественно мононуклеары, содержание лимфоцитов в ней при микроскопическом контроле должно быть не менее 953.

Полученную суспензию лимфоцитов отмывают дважды, добавляя смесь инактивированной сыворотки группы АВ (IV) и раствора Хенкса (1:10) и центрифугируя при 600g в течение

5 мин. Суспендируют лимфоциты в смеси равных объемов инактивированной сыворотки крови группы АВ (IV) зо и раствора Хенкса (без фенолового красного) в концентрации 4 „5 10 кл/мл.

Для получения лимфоцитов суспензию лимфоидных клеток в указанной концентрации наливают в бюксы кварцевого стекла так, чтобы толщина слоя жидкости была в пределах 8- 12 мм. В бюкс опускают .тонкий металлический стержень, длина которого соответствует диаметру бюкса и помещают его на магнитную мешалку. Скорость вращения стержня должна быть около 30-40 об/мин.

Облучение проводят с помощью бактерицидной лампы ДБ-30п, основная часть излучения которой имеет длину волны

254 р. Доза облучения 1,3-1,8-10 эрг/мФ 45

Облучение проводят в течение 1-1,5 мин.

Расстояние между трубкой и облучаемой поверхностью 15-20 см.

Эритроциты барана получают методом пункции яремной вены животного, де- 50 фибринируют перемешиванием деревянными палочками и течение 10 мин и сохраняют в растворе Элсвера (глюкоза 2,5 гр, лимоннокислый натрий

0,8 r и поваренная соль 0,42 г на

100 мл дистиллированной воды). Предельный срок хранения эритроцитов

3 недели. Перед постановкой реакции

9 4 розеткообразования эритроциты барана трижды отмывают раствором Хенкса и суспендируют в концентрации 4,5

5 ° 10 кл/мл в смеси равных объемов инактивированной и дважды сорбированной эритроцитами барана сыворотки крови группы AB (IV) и раствора Хенкса. Взвесь облученных лимфоцитов в концентрации 4,5-5 10 смешивают с

6 равным объемом. взвеси бараньих эритроцитов (концентрации 4,5-5 10) тщательно перемешивают и инкубируют о в течение 30 мин при 37 С. Затем центрифугируют при 400g в течение 10 мин и помещают на 1 ч в холодильник (+4 С) .

Указанную смесь наслаивают на градиент плотности фиколл-верографин (состав смотри выше) в соотношении 2:1 и центрифугируют при 600g в течение 30 мин. На границе двух фаз появляется опалесцирующее кольцо, представляющее собой взвесь В-лимфоцитав, которые собирают пастеровской пипеткой или шприцем с длинной иглой, дважды отмывают смесью раствора

Хенкса и инактивированной сыворотки крови группы АВ (IV) в соотношении

10: 1 и суспендируют в этой же смеси в концентрации, необходимой для дальнейшей работы. Осадок представляет собой Т-лимфоциты, нагруженные бараньими эритроцитами. Для того чтобы лизировать бараньи эритроциты, осадок заливают 10 мл смеси, содержащей

Ыа2 ЭДТА — 0,02 (1 часть)и Н С1

0,833 (9 частей), приготовленных

extempore выдерживают 10 мин при 18 C u центрифугируют при 600g в течение 10 мин. Полученную взвесь T-лимфоцитов дважды отмывают раствором

Хенкса и доводят до нужной концентрации.

П р и и е р 1. Из периферической крови донора тест-клеток выделяют лимфоциты. Для этого к 16 мл дефибринированной крови добавляют 16 мл раствора Хенкса, тщательно перемешивают и наслаивают на фиколл-верографин в отношении 2: 1. Отцентрифугируют при 4 С 30 мин при 1450 об/мин на рефрижераторной центрифуге К-70.Слой клеток, скопившийся на границе раздела 2-х фаз, осторожно собирают пастеровской пипеткой и дважды отмывают инактивированной сывороткой АВ (IV группы), разведенной раствором Хенкса в 10 раз, Клетки суспендируют в концентрации 5 1ОЬ кл/мл в смеси рав5 89543 ных объемов инактивированной сыворотки группы AS (EV) и раствора Хенкса.

Взвесь лимфоцитов в 50/-ной сыворотке крови группы AB (Б ) помещают в стеклянные бюксы, толщина слоя взвеси 10 мм (около 1 мл) и облучают ультрафиолетом с длиной волны 254 нм в дозе 1,3 -10 эрг/мм в течение 1 мин.

Расстояние между трубкой и.облучаемой поверхностью 15 см. Облучение про- ф водят при постоянном перемешивании суспензии с помощью магнитной мешалки.

Из эритроцитов барана, трижды отмытых раствором Хенкса, готовят l5 взвесь с концентрацией 5 10 кл/мл в инактивированной и дважды сорбированной эритроцитами барана сыворотке крови АВ (IV), разведенной равным объемом раствора Хенкса. 5 мл суспензии облученных лимфоцитов смешивают с равным объемом взвеси бараньих эритроцитов в указанных концентрациях, тщательно перемешивают и инкубируют

30 мин при 37 С, затем центрифугиру- 25 ют 10 мин при 1000 об/мин и выдержио вают в холодильнике при +4 С в течение 1 ч. Указанную смесь наслаивают на фиколл-верографин в отношении

2: 1, центрифугируют при 1450 об/мин щ в течение 30 мин.

Образовавшийся на границе двух фаз слой клеток, содержащий В-лимфоциты, осторожно собирают пастеровской пипеткой и дважды отмывают смесью раствора Хенкса и 104-ной инактивированной сыворотки крови группы

АВ (IV) в соотношении 10:1. Осадок, представляющий собой Т-лимфоциты, нагруженные эритроцитами барана,обрабатывают смесь Иа ЗДТА 0,024 (1 часть) и %14 Cl О, 83 (9 частей), приготовленных extempore для лизиса бараньих эритроцитов в течение 10 мин °

Затем полученную взвесь T-лимфоцитов дважды отмывают раствором Хенкса.

Образовавшееся на границе двух фаз кольцо, содержащее В-лимфоциты, осторожно снимают. Взвесь клеток дважды отмывают раствором Хенкса с добавлением в него 10 -ной инактивированной сыворотки крови группы AS (1Ц и доводят до нужной концентрации.

Результаты тестов, поставленных по ходу опыта следующие.

Розеткообразование определяют по числу активных Т-розеток.

Необлученных лимфоцитов с эритроцитами барана 46,24.

Облученных лимфоцитов с эритроцитами барана 77,3 .

Жизнеспособность лимфоцитов в полученных субпопуляциях (по трипаново" му синему). Т-лимфоциты 981 В-лимфоциты 97 .

9 6

Чистота полученных субпопуляций (методом подсчета розеток с T-лимфоцитами (T-POK), Т-лимфоциты 984;

В-лимфоциты 97/..

Пример 2. Из периферической крови донора тест-клеток выделяют лимфоциты, Для этого к 16 мл дефибринированной крови прибавляют 16 мл раствора Хенкса, тщательно перемешивают и наслаивают на фиколл-верографин в отношении 2:1. Центрифугируют при

1450 об/мин, +4 С в течение 30 мин на рефрижераторной центрифуге К". 70.

Снимают образовавшееся на разделе двух фаз кольцо лимфоцитов шприцем с длинной иглой и дважды отмывают их инактивированной сывороткой крови группы AB (IV), разведенной раствором

Хенкса в 10 раз. Концентрацию клеток доводят до 5 10 в 1 мл с помощью инактивированной сыворотки крови группы AB (EV), наполовину разведен" ной раствором Хенкса.

Взвесь лимфоцитов в 50 -ной сыворотке крови группы AB (EV) помещают в стеклянные бюксы, толщина слоя 12 мм и облучают ультрафиолетом с длиной волны 254 .< в дозе 1,8. 10 эрг/мм в течение 1,5 мин. Расстояние между трубкой и облучаемой поверхностью

20 см. Облучение проводят при постоянном перемешивании суспензии с помощью магнитной мешалки.

Из трижды отмытых эритроцитов барана готовят взвесь с концентрацией 4,5-10 кл/мл в инактивированной и дважды сорбированной эритроцитами барана сыворотке крови группы АВ (IV), пополам разведенной раствором

Хенкса.

Смешивают равные объемы облученных лимфоцитов и бараньих эритроцитов в указанных концентрациях, тщательно перемешивают и инкубируют 30 мин при

37 С, "-атем центрифугируют 10 мин при 1000 об/мин и выдерживают в хоп лодильнике при +4" C в течение 1 ч.

Указанную смесь наслаивают на фиколлверографин в соотношении 2:1, центрифугируют при 1450 об/мин в течение

30 мин.

895439

Формула изобретения

Составитель С.Малютина

Редактор О.Юркова Техред А, Савка Корректор E. Рошко

Заказ 11533/8 Тираж 716 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, N-35, Раувская наб., д.4/5

Филиал ППП "Патент", г.ужгород, ул.Проектная,4

Осадок, представляющий собой

Т-лимфоциты, нагруженные эритроцитами барана, обрабатывают смесью Ма 1 ЭДТА

0,02Ж (1 часть) и ИН Г1 0,831 (9 частей), приготовленных extempore для лизиса бараньих эритроцитов, в течение !0 мин. Затем полученную смесь Т-лимфоцитов цважды отмывают раствором Хенкса и доводят до нужной концентрации. !О

Результаты тестов, полученных по ходу опыта следующие.

Розеткообразование определяют по числу активных Т-розеток.

Необлученных лимфоцитов с эригроцитами барана 37,74.

Облученных лимфоцитов с эритроци-. тами барана 58,4ь .

Жизнеспособность лимфоцитов в полученных субпопуляциях (по трипа- щ новому синему) T-лимфоциты 981, B-лимфоциты 961.

Чистота полученных субпопуляций (методом подсчета Т-РОК) Т-лимфоциты 973, В-лимфоциты 97%. 25

Предложенный способ позволяет разделить лимфоциты периферической крови и получить субпопуляции клеток высокой степени чистоты, способ не требует дефицитного импортного фермента, при этом обработка известным способом занимает 1,5 ч, а облучение предложенным способом 2 мин.

1. Способ разделения лимфоцитов периферической крови путем проведения реакции розеткообразования лимфоцитов с эритроцитами с последующим центрифугированием полученных розеток в градиенте плотности фиколл-верографин, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа, перед проведением реакции розеткообразования один из компонентов реакции облучают ультрафиолетовыми лучами при длине волны 250-260 нм в дозе 1 33 у

1,8-10 эрг/см в течение i-1,5 мин.

2. Способ по п.1, о т л и ч а ю— шийся тем, что облучению подвергают лимфоциты.

3. Способ по пп.1-2, о т л и ч а ю шийся тем„ что облучению подвергают эритроциты.