Способ получения @ - @ -галактозидазы

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ - J) -ГАЛАКТОЗ ИДАЗЫ заключающийся в культивировании продуцента вида Bacillus .иЪtilis на питательной среде, разрушении биомассы, осаждении |нуклеиновых кислот и5 бесклеточного экст 13кта и выделении целевого продукта путем фракционирования белкового раствора сульфатом аммония, отличающийся тем, что, с целью увеличения удельной активности и выхода -D-галактозидазы, в качестве продуцента использьтот штамм Bacillus subtilis ИБП-101, в процессе выделения в растворы добавляют июны Мп в концентрации 210 «-1-10 М, дйтиотреитбл в концентрации 2 «10 -110 7М, Щ а после осаждения нуклеиновых кислот U) фермент стабилизируют пропусканием через ионообменную смолу КБ 51-2.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

3(50 С 12 N 9 38

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н ABTOPCH0IVIV СВИДЕТЕЛЬСТВУ .

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ CCCP

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21 )3494623/28-13 (22) 17.09.82 (46) 30.03.84. Бюл. Р 12 (72) И.В.Виха, С.И.жолудева, Т.A.Êàñüÿíoâà и С.И.Кудрявцев (71) Всесоюзный научно-исследова,тельский институт биологического приборостроения (53) 577.15(088,8) (56) 1ъ .Purification composition and.

Molecular eight of the P -galactosidase of Escherichia со).i К-12.-Jourпа1 Biol .Chem, 1965,ч.240, Р 6, 2468-2577.

2. Anems P.J. Purification and

some properties of P-galactosidasa

J.Âàcil1us subtilis. — Biochimica

et Biophysica acta, 1964, 89, 9 3, 495-502.

„,Я0„„1 Î82812 A (54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ /3-Q -FAJIAKТОЗИДЛЗЫ, заключаюшийся в культивировании продуцента вида Bacillus .иЪtilis на питательной среде, разрушении биомассы, осаждении нуклеиновых кислот иэ бесклеточного экст1 йкта и выделении целевого продукта путем фракционирования белкового раствора сульфатом аммония, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью увеличения удельной активности и выхода -D-галактозидазы, в качестве продуцента используют штамм Bacillus subtilis ИБП-101, в процессе выделения в растворы добавляют ионы Mn в концентрации 2 10 -1-10 M дитиотреитол в концентрации 2 10 -1 10 ФM, Я а после осаждения нуклеиновых кислот фермент стабилизируют пропусканием через ионообменную смолу КБ 51.2.

1082812

Изобретение относится к способам получения и очистки ферментных препаратов иэ микроорганизмов, а именно к .способу получения ферментного препарата р --Ь- галактоэидазы (лактазы), (р -П-галактоэид галактогидролазы 5

3.2 1.23 иэ Bactillus subtilis.

Изобретение может быть использовано в микробиологической промышленности для получения иммобилизованной на различных носителях p --D-галактози-.)0 дазы и изготовления ферментных электродов, предназначенных для контроля эа использованием углеродов при культивировании микроорганизмов, диагностических иммуноферментных комплек-. сов, для получения препаратов, предназначенных для компенсации лактазной недостаточности у взрослых и детей, для гидролиза лактозы и утилизации побочных продуктов молока.

Известно получение препарата р-галактоэидазы из специально полученного методами индукции и селекции штамма Escherichia coli, включающее осаждение бесклеточного экстракта сульфатом аммония и последующую 25 гельфильтрацию на сефадексе Г-200(1).

Однако Е.coll относится к условно патогенным микроорганизмам и поэтому производство препаратов на основе штаммов кишечной палочки неже- 30 лательно для микробиологической, медицинской и пищевой промышленности.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому положительному эффекту к предлагаемому явля- 35 ется способ получения p --D-галактоэидазы, заключающийся в культивировании продуцента вида Bacillus

subtilis на питательной среде, разрушении биомассы, осаждении нуклеи- 40 новых кислот иэ бесклеточного экстракта и выделении целевого продукта путем фракционирования белкового раствора сульфатом аммония. Способ включает также стадию фракционирования ацетоном и позволяет привести

20-кратную очистку фермента. Удельная активность р --галактоэидазы, из iеренная при 50 С равна 239 E/ìã белка, выход по активности 33%„ по белку 1,6% (2)°. 50

Недостатком данного способа очистки является инактивация фермента в процессе фракционирования сульфатом аммония, .ацетоном, следствием чего является низкий выход галактозидазы 55 и недостаточно высокая удельная активность °

Цель изобретения - увеличение удельной активности и выхода p-галактоэидаэы. 60

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения

P-D-галактоэидазы, заключающемуся в культивировании продуцента вида

Bac illus subtilis Ha HTaTe HoB cpe-gg де, разрушение биомассы, осаждении нуклеиновых кислот из бесклеточного экстракта и выделении целевого продукта путем фракционирования белкового раствора сульфатом аммония, в качестве продуцента используют штамм

Bacillus ЯПЬtilis ИБП-101, в процес се выделения в растворы добавляют ионы Мп в концентрации 2 ° 10 1 10 М и дитиотреитол в концентрации

2 ° 10 -1"10 4 М, а после осаждения нуклеиновых кислот фермент стабилизируют пропусканием через нонообменную смолу КБ 51 2.

Сущность предлагаемого способа заключается в том, что при получении ферментного препарата р--галактозидазы путем культивирования продуцента вида В.subtilis на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, разрушения биомассы, центрифугирования гомогената, осаждения из бесклеточного экстракта нуклеиновых кислот и фракционирования белкового раствора сульфатом аммония в качестве продуцента используют штамм В.subtilis

HBII-101, перед выделением галактоэидазы из аммонийно-сульфатной фракции белков фермент стабилизируют пропусканием через ионообменную смолу

КБ-51 2 и добавлением на всех последующих стадиях в растворы Мп и дитиотреитола, а выделение осуществляют, проводя последовательно ультрафильтрацию, хромотографию на ДЭАЗцеллюлозе и ЛЗАЗ-сефадексе и диализ против ацетатного буфера рН 6,3.

Способ осуществляют следующим образом.

Культивирование продуцента

В. subtilis ИБП-101 проводят при

37 С глубинным способом в 20 л фермента на жидкой питательной среде следующего состава, г/л: КН РО4 х 2Н20 27; N „SO4 7HzO 0,4; пентон 1,5; (NH4J 50+ 4р СаСЙ2 0 01; Fe504x

«7Н О 0,4; дрожжевой экстракт 1; лактоэа 20, лимоннокислый натрий (однозамещенный ) 1,9, рН 7,2 в течение

20+2 ч. Биомассу отделяют центрифугированием, клетки промывают 0,85%-м

МаС и ресуспендируют в дистиллированной воде из расчета на 1 r биомассы

2-3 мл воды. Суспензию разрушают ультразвуком и экстрагируют из нее белки 2,3%-м раствором NaCt при перемешивании в течение нескольких часов при 5 С центрифугируют при

15000 об/мин в течение 30 мин. Удельная активность галактозидазы на этой стадии 1,2-1,4 Е/мг белка. Нуклеиновые кислоты осаждают из супернатанта сульфатом аммония при рН 6,8 до достижения степени насыщения 0,25, а супернатант после диализа обрабатывают ионообменной смолой КБ 51 2.

1082812

Использование катионита КБ-51 ° 2 для обработки фракции белков иэ кле" ток В.subtilis приводит к тому, что большая часть портеинаэ удаляется из раствора, а оставшиеся протеиназы удаляются после осаждения (3-ra- 5 лактоэидазы сульфатом аммония.при степени насыщения 0,75. Удельная активность р -галактозидазы в процессе обработки смолой возрастает лишь на 30%, но удаление протеинаэ 10 исключает протеолиз р -галактозидазы на всех последующих стадиях очистки и таким образом стабилизирует фермент.

К 100 мл раствора сульфатной фрак-.15 ции белков прибавляют 1/5 ч. по объему набухшей смолы КБ-51 2 в Ма-форме, уравновешенной 0,05М фосфатным буфером (рН 6,7), и оставляют на 1 ч при 4ОC при периодическом перемешивании; раствор декантируют и осаждают из него -галактозидазу сульфатом аммония до степени насыщения

0,75 °

Удельная активность протеинаэ до обработки смолой ЗЕ/мг белка, после обработки смолой и осаждения сульфатом аммония 0,3 Е/мг белка.

Удельная активность галактоэидазы до обработки КБ-51 2 — 1,4 Е/мг белка, после обработки 1,9 Е/мг белка. 30

Фракцию белков, осажденную сульфатом аммония со степенью насыщения

0,75, подвергают ультрафильтрации через полупроницаемые ацетатцеллюлозные мембраны типа УАМ-500 марки 35

Владипор. На этой стадии получают препарат с удельной активностью

7 Е/мг белка, с выходом по белку

31,4%, по активности 148%. Препарат подвергают хромотографии и рехрома- 40 тографии на ДЭАЭ-целлюлоза, уравновешенной 0,005М фосфатным буфером (рН 7,4 I, содержащим 0,05М NaC3,,2 .10 - 1-10 +М дитиотреитола и

2 10 — 1-10 М МпСР2 (буфер А) °

Элюцию 8-галактозидазы проводят ли нейным градиентом NaCC 0,05-1М в бу,фере А. Фермент выходит при концентрации МаСР 0,25-0,45. Активные фракции концентрируют и диализуют против буфера A.

Удельная активность р -галактозй- . даэы на этой стадии 23,4 Е/мг белка, выход по белку 12,1%, по общей активности 190%.

Рехроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе проводят в тех же условиях и получают препарат с удельной активностью

198 E/Mr белка, выходом по белку 8,6 и 220% по активности.

Препарат подвергают хроматографии на ДЭАЭ-сефадексе, уравновешенном 0,05М ацетатным буфером (рН 7,0), содержащим 0,005M NaCK, 10 +М дитиотреитола и 10 M MnC62 (буфер Б).

Элюцию проводят .линейным градиентом 65

МаС3 0,005-0,2М в буфере Б. Активные фракции диализуют против буфера

Б (рН 6,31, получают препарат Р --галактоэидазы с удельной активностью

467 Е/мг белка, выходом по белку 3,0 и 936% по активности. Препарат ф -галактоэидаэы можно хранить беэ потери активности в 2,2 М растворе сульфата аммония (рН 6,3 ).

Активность р -галактоэидазы определяют с п -нитрофенил-р-Ю-галактопираноэидом в качестве субстрата. 3а единицу активности (Е) принимают такое количество фермента, которое каталиэирует расщепление 1 мкмоль субстрата в минуту при оптимальных условиях.

Пример 1. Культивирование продуцента ф .Subtilis ИБП-101 проводят при 37sC глубинным способом в

10-литровом ферменте фирмы КВ на жидкой питательной среде следующего состава, г/л: пептон 1,5; сульфат аммония 4,0; калий фосфорнокислый ,однозамещенный 27,0; магний сернокислый семиводный 0,4; кальций хлористый 0,01, железо сернокислое семиводное 0,4; натрий лимоннокислый 1,9 дрожжевой экстракт 1,0; лактоза 50, рН 7,1 в течение 20 ч до достижения стационарной фазы.

После завершения ферментации клетки отделяют от культуральной жидкости центрифугированием, трижды отмывают 0,85%-м NaCE и ресуспендируют в трех объемах дистиллированной воды, содержащей 1 10 "моль

ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота ), и гомогенизируют.

Разрушение клеток ультразвуком проводят на ультразвуковом дезинтеграторе Soniyrer=150 фирмы MSE порциями по 70 мл в течение 5 мин. Доводят рН до 7,2 0,5 м фосфатным буфером (рН 7,8l, и экстрагируют белки при перемешивании в течение нескольких часов при 4 С.

После центрифугирования при

16 тыс.оборотах в течение 30 мин иэ супернатанта осаждают нуклеиновые кислоты сульфатом аммония до степени насыщения 0,25, поддерживая рН

6,8 ° 1 M Na0H. После "повторного центрифугирования супернатант.обрабатывают ионообменной смолой КБ-51 2 для удаления протеаз. На каждые 100 мл раствора сульфатной фракции белков прибавляют 1/5 ч по объему набухшей смолы КБ-51 ° 2 в Na-форме уравновешенной 0,05 M К-Ма-фосфатным буфером (рН 6,7), и оставляют на 1 ч при

4 С при периодическом перемешивании.

Затем раствор декантируют и осаждают из него (b-галактозидаэу сульфатом аммония до степени насыщения 0,75 поддерживая рН 7,2 1 М Na0H. Полученный осадок отделяют центрифугировани1082812 ем при 16-18 тыс. оборотах в течейие 30 мин и растворяют в 0,05 М

К-)4а -Фосфатном буфере (рН 7,2 t, содержащем 5 ° 10 M МаСФ, 1 10-4 М ди, тиотреитола и 2 10" M MnCE> .

Затем белковый раствор фильтруют через полупроницаемые ацетатцеллюлозные мембраны типа УАМ-500 марки

Владипор, до объема 1/3 от исходного с последующей диафильтрацией в шестикратном объеме к исходному 5*10 М

К-Ма-фосфатного буфера (рН 7,4), содержащего 5 10 hlaCE,1 10 4 дитио- треитола, 2-10 " М МпС1 (буфер А ) до объема 1/3 от первоначального.

Полученный препарат подвергают хроматографии и рехроматографии на

ДЕАЕ-целлюлозе, уравновешенной буфером А, на колонке 25 -300 мм. Элюцию ) -галактозидазы проводят линейным градиентом NaCE 5.10 3 -1M в буфере A. Скорость элюции 60 мл/ч, время градиентной элюции 24 ч. Фермент выходит при концентрации NaCE

0,25-0,45М. Активные фракции собирают, концентрируют и диалиэуют против буфера А.

Рехроматографию на ДЕАЕ-.целлюлозе проводят в тех же условиях, но полученные активные фракции концентрируют и диализуют против 0,05 М ацетатного буфера (рН 7,0), содержащего 5.10 NaCE, 1.10 4 дитиотреитола и 1 -10 м мпс0л, (буфер Б ), г-подготавливая к хроматографии на

ДЕАЕ-сефадексе.

Хроматографию на ДЕАЕ-сефадексе, уравновешенном буфером Б, проводят на колонке 12 600 мм. Элюцию ведут линейным градиентом МаС(5-10

2 .10 " M в буфере Б при скорости

30 мл/ч. Активные фракции, выходящие первыми двумя пиками, собирают, концентрируют на полупроницаемой мембране УАМ-300 марки Бладипор или в полиэтиленгликоле мол. массой

40000 до концентрации белка 40 мг/мл и диализуют против буфера Б (рН 6,3)

Препараты р -галактозидазы хранят в 2,2 М растворе сульфата аммония (рН 6,3) с концентрацией белка примерно 20 мг/мл.

Активность р -галактозидазы определяют с !1--нитрофенил-Р-))-галактопиранозидом в качестве субстрата. За единицу активности принимают такое количество фермента, которое катализирует расцепление 1 мкмоль субстрата в минуту при температуре 37 С и о рН 6,3. собу, после высаливания сульфатом аммония до степени насыщения

0 75 растворяют в 0,05 М К-Йа-фосфатном буфере, содержащем 5-10

НаСE, 2 10 + МоСР2, 2-10 М дитиотреитола. Активность препарата, полученного на данной стадии при укаэанных концентрациях МлСР и дитиотреитола, равна 13,5 Е/мг, что превышает удельную активность препарата, полученного при более высоких концентрациях активаторов (табл. 1).

Таким образом, предлагаемый способ получения ферментного препарата р-галактозидазы позволяет избежать инактивации фермента в процессе очистки вследствие его стабилизации, а предлагаемая схема очистки позво,ляет повысить удельную активность фермента в два раза по сравнению с

55 лучшими препаратами, увеличить выход по активности в 30 раз и достигнуть

320-кратной очистки. Так как фермент имеет рН оптимум в широком диапазоне (рН 6-9), препарат может быть применен для приготовления иммобилизованных ферментов с цеЛью последующего использования в практических целях.

Результаты очистки приведены в табл. 1 °

Пример 2. Препараты g галактоэидазы, полученйые по вышеописанному способу, но без внесения в раст5 воры Мп и дитиотреитола, выдерживают в течение 15 мин при 41 С в

0,1 М К-Ма-фосфатном буфере рН 6,3 в присутствии различных солей и 2-меркаптоэтанола и беэ них. Затем инку 0 бируют в тех же условиях в течение

10 мин с 1,2 мг субстрата — n -нитрофенил-р-П-галактопираноэида. По окончании инкубации измеряют активность фермента.

Результаты приведены в табл. 1.

Результаты опытов показали, что достижение положительного р< фекта невозможно без добавления Мп и дитиотреитола,так как полученный фермент обладает крайне низкой удельной ак

20 тивностью (48,6 Е/мг).

Добавление к очищенному ферменту ионов Mn2+ и дитиотреитола или 2-меркаптоэтанола активирует фермент, но при этом его активность не достигает значений, характерных для препарата, полученного при добавлении активаторов в процесое выделения.

Пример 3. Преперат р -галактозидазы, полученный по описанному спо1082812

Таблица1

Удельная активность, E/ìã

Выход белку, %

Степень очистки

Выход по общей активности, %

Общий . белок, мг

Общая активность

Стадия очистки

12100 18162,1 1,49 — 100 100

9334 17953,0 1,92 1,3 77,1 98,8

Исходный экстракт

Смола КБ-.51 2

Фракция белков 75%-ro насыщения сульфатом аммония

Ультрафильтрация, УАМ-500

9200 32328,6

3800 26880,0

2,3 76,0 178,0

4,7 31,4 148,0

3,49

7,0

Хроматография на ДЕАЕцеллюлозе с диализом против 0,005 М К-На-фосфатного буфера рН 7,4

Рехроматография на ДЕАЕцеллюлозе с диализом против 0,05 М ацетатного буфера рй 7,0 .Хроматография на ДЕАЕ-сефадексе с диализом проатив 0,05 М ацетатного буфера рН 6,3

1470 34508,0 15,7 23,47 12,1 190,0

1040 206880,0 ;198,92 133,5 8,6 1139,0

364 170000,0 467,03 313,4 3,0 936,0

Таблица 2

Влияние солей, дитиотреитола и 2-меркаптоэтанола на активность -галактозидазы при 41 С о

Концентрация, моль

Активность

Вещество удельная, Е/мг относительная, Ъ

1 103

86,7

178, 4

42,9

88,3

47,8

98,4

101,3

2.10

1 ° 10

69,7

60,0

72,9

97,9

1 10+

71,3

1 .10.64,8

2-Меркаптоэтанол

1 -10

71,3

146,7

Контроль (без добавок!

48,6

100

ВНИИПИ Заказ 1677/24 - Tape 522 Подписное

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул.Проектная, 4

MgC22

С а С 12

ZnSO+

Мп$0 ОН 0

NaC1

БгC1g 6Н 0

CdS0 ОН 0

6Н20

Дитиотреитол

Иа280д ° 10Н О

208,4

143,4

123,5

150,0

200,0

146,7

133,3