Способ получения растворимого холерного @ -антигена для иммунизации продуцентов холерных агглютинирующих сывороток

 

СПОСОБ РАСТВОРИМОГО ХОЛЕРНОГО 0-АНТИГЕНА ДЛЯ ИММУНИЗАЦИИ ПРОДУЦЕНТОВ ХОЛЕРНЫХ АГГЛЮТИНИРУЮЩИХ СЫВОРОТОК, включающий выращивание холерных вибрионов на питательном агаре, приготовление микробной взвеси, экстрагирование, центрифугирование, диализ и лиофйльную сушку, отличающийся TBMj что, с целью повьшения активности и СП1ЕЦИФИЧНОСТИ 0-антигена, микробную взвесь готовят в концентрации 100 МЛРД. м.кл. в 1 мл дистиллированной воды, перед центрифугированием взвесь инактивируют формалином из расчета 0,75-0,85 мл на 100мн и повторно экстрагируют в течение суток, затем сорбируют насадочную (Л жидкость активированным углем в количестве 4,5-5,5 г на 100 мл, концентрируют растворимый антиген вьмораживанием , а после диализа проводят § стерилизующую фильтрацию. 00 СП

СО1ОЭ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

1 Р4 А 61 К 39/02 )4.,1 !

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

И АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ЫЫХ l

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3408421/28-13 (22) 10.03.82 (46) 07.12.86. Бюл. У 45 (71) Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и

Дальнего Востока (72) С.Н. Тюменцев, Н.М. Адреевская, Т .Д. Казаренко и М.В. Безносов (53) 615.375(088.8) (56) Авторское свидетельство СССР

9 380326, кл. А 61. К 23/00, 1975.

Яговкин Э.А. Методические рекомендации по получению и применению очищенных соматических антигежв холерного вибриона эльтор в иммунохимических, иммунологических и микробиологических исследованиях. Ростовгна-Дону, 1980. (54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ РАСТВОРИМОГО ХОЛЕРНОГО 0-АНТИГЕНА ДЛЯ ИММУ„SU„» 10 040 А

НИЗАЦИИ ПРОДУЦЕНТОВ ХОЛЕРНЫХ АГГЛЮТИНИРУЮЩИХ СЫВОРОТОК, включающий выращивание холерных вибрионов на питательном агаре, приготовление микробной взвеси, экстрагирование, центрифугирование, диализ и лиофильную сушку, отличающийся тем, что, с целью повышения активности и специфичности О-антигена, микФ робную взвесь готовят в концентрации 100 мпрд. м.кл. в 1 мл дистиллированной воды, перед центрифугираванием взвесь инактивируют формалином иэ расчета 0,75-0,85 мл на 100мя и повторно экстрагируют в течение а суток, затем сорбируют насадочную жидкость активированным углем в количестве 4,5-5,5 r на 100 мл, концентрируют растворимый антиген вымо- С раживанием, а после диализа проводят стерилизующую фильтрацию.

1085040

Холерные вибрионы, выращенные на агаре Мартена или Хоттингера, смывают дистиллированной водой. Микробную взвесь доводят до концентрации

100 млрд. м.кл. в 1 мл дистиллированной воды, перед центрифугированием инактивируют формалином из расчета

0,75-0,85 мл на 100 мл взвеси и экстр

Изобретение относится к медицине, а именно, к получению диагностических препаратов, и может быть использовано в сывороточном производстве, в частности, для иммунизации кроликов- 5 продуцентов холерной агглютинирующей

О-сыворотки.

Известен способ получения растворимого холерного антигена путем экстрагирования и фракционирования. Од нако этот способ трудоемок и позволяет получить О-антиген с низкой специфичностью.

Известен также способ получения растворимого холерного О-антигена для иммунизации продуцентов холерных агглютинирующих сывороток, включающий выращивание холерных вибрионов на питательном агаре, приготовление микробной взвеси, экстрагирование, дентрифугирование, диализ и лиофиль4ую сушку.

Однако этот способ также недостаточно производителен, а получаемый антиген имеет недостаточно высокую 25 активность и специфичность.

Целью изобретения, является повыше-;, ние активности и специфичности О-ан-. тигена.

Указанная цель достигается тем, что выращивают холерные вибрионы на питательном агаре, приготавливают взвесь, экстрагируют, центрифугируют, диализуют и лиофильно высушивают.

Отличительной особенностью является то, что микробную взвесь готовят в концентрации 100 млрд.м.кл. в

1 мл дистиллированной воды, перед центрифугированием микробную взвесь ,инактивируют формалином из расчета

0,75-0,85 мп на .100 мп и повторно экстрагируют в течение суток, затем сорбируют насадочную жидкость активированным углем в количестве 4,5—

5,5 г на 100 мл, концентрируют растворимый антиген вымораживанием, а после диализа проводят стерилизующую фильтрацию.

Способ выполняется следующим об разом.

50 рагируют в течение суток. Формалин инактивирует вибрионы и денатурирует белки, которые удаляют центрифугированием. Оставшиеся в надосадочной жидкости белки сорбируют активированным углем в количестве 4,5-5,5 r на 100 мл. Затем растворимый антиген концентрируют вымораживанием, диализуют против проточной воды, затем проводят стерилизующую фильтрацию.

Пример . Культуру холерных вибрионов серотипов Ина.ба и ОГава, выращенную в течение 3 ч на 1Х-ной пептонной воде (рН 7,6), пересевают в четверти с агаром Мартена или Хоттингера (рН 7,6) и инкубируют при

37 С в течение 18 ч. Культуру смывают дистиллированной водой (pH 7,2), концентрацию доводят до 100 млрд.м.кл. в .1 мл и помещают на 4 ч в термостат при 37 С, перемешивают каждые 30 мин.

Добавляют на 100 мп взвеси 0,8 мл формалина и выдерживают в бытовом холодильнике еще 20 ч. Затем взвесь центрифугируют при 8000G в течение

30 мин. В надосадочную жидкость вносят активированный уголь — 5 r на

100 мл, постоянно перемешивая, выдерживают при 37 С в течение 1 ч, после чего фильтруют через бумажные фильтры. Содержащийся в жидкости растворимый антиген концентрируют путем вымораживания воды. Сконцентриро- ванный растворимый 0-антиген Серотипа Инаба и Огава соединяют в равных объемах и диализируют против проточной воды 3 сут.

Затем раствор антигена фильтруют через стерилизирующие пластины и подвергают лиофильной сушке. Выход сухого вещества составляет 1

1,2 мг/мл.

Полученное вещество является растворимым холерным антигеном, который содержит, Ж: белка 8,7, полисаха-, ридов 38, HK 1,7, липицов 24, 1.

Преимуществом указанного способа является то, что по разработанной технологии в любой лаборатории может быть приготовлено необходимое количество растворимого холерного О-антигена и для получения растворимого антигена не требуется сложного дорогостоящего оборудования. Препарат высокоспецифичен, при постановке РП по Оухтерлони он образует одну линию преципитации с.холерным гаммаглобуI

1085040

Корректор М. Пожо

Заказ 6590/1 Тираж 660 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 лином и нативными 0- и OH-холерными сыворотками, в то время как корпускулярный холерный О-антиген, рекомендованный для производства технической документацией, и цельный раство- 5 римый холерный антиген, полученный по известному способу, образуют с холерным гамма-глобулином четыре линии, а с нативными холерными 0- и

ОН-сыворотками две — три линии.

1О

Растворимый и корпускулярный холерные антигены обладают неодинаковой антигенной активностью при одйнаковых способах их введения кроликами. 15

Растворимый холерный антиген высокоактивен при введении кроликам внутривенно, в лимфоузлы и подушечки лапок; холерный корпускулярный 0-анти- 20 ген проявляет антигенные свойства только при внутривенном введении. Сыворотки, полученные от кроликов, иммунизированных растворимым .антигеном

25 в подушечки лапок, в 2-2,5 раза активнее и специфичнее сывороток кроликов, иммунизированных корпускулярным

0-антигеном (р (0,05).

Сухой растворимый антиген, приготовленный по предложенному способу, 30 может храниться длительное время (2 r — срок наблюдения), удобен в работе.

Составитель

Редактор П. Горькова Техред В.y ap

Исследования биологических свойств пока зали, что препарат, полученный по предлагаемому способу, обладает большей антигенной активностью. При однократном введении кроликам на десятый день титры агглютининов достигали 1:3200, а при иммунизации кроликов известным препаратом титры ьгглютининов были в пределах 1:320.

Титры вибриоцидных антител в крови кроликов, иммунизированных предложенным препаратом, были также выше.

Средняя иммунизирующая доза (ЕД ) предлагаемого препарата быпа равна

0,14 мкг, а известного препарата

14,6 мкг, т.е. иммуногенность предлагаемого препарата превосходит в десятки раз.

Следовательно, по данным иммунохимических и биологических исследова" ний растворимый специфический холерный антиген, полученный по предлагаемому способу, соответствует по специфичности полисахаридам, полученным Э.А. Яговкиным (1980), а по антигенным и иммуногенным свойствам превосходит их. Кроме того, способ по лучения.предложенного препарата проще по технологии, менее трудоемок и более производителен,так как на технологический цигп затрачивается s 2,5 раза меньше времени по сравнению

1 с известным способом.