Способ получения смеси флавоноидов с противовоспалительной активностью

 

(19)SU(11)1089789(13)A1(51)  МПК ⁶    _A61K35/78(12) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯк авторскому свидетельствуСтатус: по данным на 27.12.2012 - прекратил действиеПошлина:

(54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СМЕСИ ФЛАВОНОИДОВ С ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНОЙ АКТИВНОСТЬЮ

Изобретение относится к способам получения биологически активных природных соединений, в частности к способу получения флавоноидов, обладающих противовоспалительной активностью. Известен способ получения флавоноидов путем осаждения флавоноидных фракций из растительных экстрактов ацетатом свинца, очистки их хроматографией на колонках с силикагелем, целлюлозой, полиамидом, сефадексом и другими адсоpбентами. Однако данный способ не позволяет получить смесь флавоноидов, обладающую противовоспалительной активностью. Наиболее близким техническим решением по технической сущности и достигаемому эффекту является способ получения смеси флавоноидов с противовоспалительной активностью путем экстракции растительного сырья метанолом, упаривания экстракта до сухого остатка и очистки хроматографированием на колонке с полиамидным сорбентом. Согласно известному способу соцветия календулы обрабатывают хлористым метиленом, экстрагируют водным спиртом и очищают водно-спиртовое извлечение хлористым метиленом, центрифугируют и хроматографируют на колонке с полиамидным сорбентом. К недостаткам известного способа относится то, что он не обеспечивает получения смеси лимоцитрин-7-глюкозида, лимоцитрин-3-глюкозида и лимоцитрин-7-диглюкозида, обладающих наиболее высокой противовоспалительной активностью. Целью изобретения является расширение сырьевой базы и повышение противовоспалительной активности целевого продукта. Поставленная цель достигается тем, что в способе получения смеси флавоноидов с противовоспалительной активностью путем экстракции растительного сырья метанолом, упаривания экстракта до сухого остатка и очистки хроматографированием на колонке с полиамидным сорбентом, предложено в качестве сырья использовать надземную часть бинерции окружнокрылой (Bienertia cycloptera Bge), перед экстракцией растительное сырье обезжиривать хлороформом, а перед очисткой на полиамидном сорбенте сухой остаток растворять в воде, промывать эфиром и обрабатывать бутанолом. П р и м е р. Измельченную воздушно-сухую надземную часть бинерции окружнокрылой (5 кг) обезжиривают настаиванием с хлороформом (2 раза по 29 л) в течение 48 ч. Хлороформный раствор сливают и сырье экстрагируют 10 раз метанолом (по 20 л) настаиванием каждый раз по 20 ч. Объединенные метанольные экстракты сгущают при пониженном давлении до объема 1,5 л, разбавляют 1 л воды, промывают эфиром (5 раз по 0,5 л) и бутанолом (10 раз по 0,5 л). Бутанольное извлечение упаривают при пониженном давлении досуха, остаток (25 г) растворяют в 100 мл воды и наносят на колонку с 500 г полиамидного геля. Колонку промывают 3 л воды, затем 2 л 75%-ного метанола. Из метанольного элюата после отгонки растворителя получают 2,83 г желтой аморфной смеси флавоноидов, проявляющейся на бумажной хроматограмме в 15%-ной (система А) и 60% -ной (система В) уксусной кислоты при опрыскивании 5%-ным раствором едкого натра. Смесь флавоноидов (1 г) растворяют в 30 мл воды и наносят на колонку с 50 г полиамидного геля. Колонку промывают 0,5 л воды, затем водно-метанольными растворами: 20%-ным метанолом вымывают смесь фракций III и II, 30-50% -ным метанолом смесь фракций I и II, а 75%-ным метанолом фракций I. Рехроматографией в тех же условиях и многократной перекристаллизацией из смеси метанол вода (1:1) получают чистые фракции I,II и III. Хроматографией исходной смеси флавоноидов на пластинах Silufol-254 параллельно с чистыми флавоноидами I, II и III известной концентрации (в системах этилацетат-метанол-вода 10:2:1, и н-бутанол-уксусная кислота-вода, 4: 1: 5) устанавливают весовое соотношение флавоноидов I, II и III в смеси 2:1: 2. Флавоноид I: состав С₂₃H₂₄O₁₃, т.пл. 233-235^оС, [ α_D²⁰ 50,4^о (с 0,5 пиридин-метанол 1: 1), Rf 0,16 (А, 0,46, (В) λ _макс (СН₃ОН) 295,359 нм; λ _макс (СН₃ОН + NaOCH₃) 272,414 нм, λ _макс (СН₃ОН + AlCl₃) 263, 375 нм; λ _макс (СН₃ОН + AcONa + H₃BO₃) 260, 366 нм (наличие 3-ОН и 4^'-ОН). Флавоноид II: состав С₂₃Н₂₄О₁₃, т.пл. 242-245^оС, [ α_D²⁰ 6,3^о (с 0,5, пиридин-метанол, 1:1), Rf 0,24 (А), 0,69 (В), λ _макс (СН₃ОН) 285, 347 нм; λ _макс (СН₃ОН + +NaOAc) 293, 369 нм; λ _макc (СH₃OH + AlCl₃) 268, 396 нм (наличие 4^'-OH и 7-ОН). Флавоноид III: С₂₉Н₃₄O₁₈, т.пл. больше 340^оС, [ α_D²⁰ 63,3^о (с 0,5, пиридин-метанол 1:1), Rf 0,53 (A), 0,77 (В) λ _макс (СН₃ОН) 287, 340 нм; λ _макс (СН₃ОН + NaOCH₃), 286, 395 нм (наличие 3-OH и 4^'-ОН). В ПМР-спектрах силилированных производных I, II и III есть сигналы четырех ароматических протонов (2Н-квартет при 7,2 м.д. 1Н дублет при 6,8 м.д. 1Н-синглет при 6,4 м.д.), соответствующих 2^',6^',5^',6 протонам 3,5,7,8,3^' и 4^'-замещенных флавонов, 1Н-синглет при 12,3 м.д. соответствующий несилилимеруемой ОН при С₅; 6Н синглет при 3,9 м.д. соответствующий двум метоксильным группам, связанным с бензольными кольцами. В ПМР-спектрах производных I и II есть мультиплетные сигналы шести углеводных протонов, а в спектре производного III двенадцати углеводных протонов в области 3,40-4,00 м.д. Сигнал С₁ углеводного протона I и III обнаруживается при 5,0 м.д. а II при 5,8 м.д. что характерно для С₇ и С₃ о-глюкозидов. Для ацетилирования производных I и II смесь 40 мг I (или II), 1 мл безводного пиридина и 2 мл свежеперегнанного уксусного ангидрида выдерживают при 20^оС 24 ч, сливают в ледяную воду и выпавший осадок отфильтровывают, промывают водой и перекристаллизовывают из спирта. Получают из производного I гептаацетат IV с т.пл. 164-165^оС; R_f 0,9; из производного II гептаацетат V с т. пл. 167-168^оС, R_f 0,85. С целью кислотного гидролиза производных I и II смесь 40 мг I (или II), 1 мл этанола, 3 мл 10%-ного раствора серной кислоты нагревают 5 ч, отфильтровывают выпавший осадок и перекристаллизовывают из спирта. Получают агликон VI состава С₁₇Н₁₄О₈, т.пл. 287-289^оС, R_f 0,35, представляющий собой флавонол-лимоцитрин. Производное I является лимоцитрин-7-глюкозидом, производное II лимоцитрин-3-глюкозидом и производное III лимоцитрин-7-диглюкозидом. Сравнение противовоспалительных свойств полученной смеси флавоноидов с рутином проводили на моделях экспериментального перитонита, плеврита и pellet-гранулеме. Смесь флавоноидов в значительно меньших дозах, чем рутин (5 мг/кг вместо 100 мг/кг), подавляла экссудацию воспалительной жидкости при перитоните. Смесь флавоноидов бинерции в дозе 10 мг/кг подавляет развитие плеврита на 40% а рутин в 10 раз большей дозе (100 мг/кг) на 27% а также в значительно меньших дозах (5 мг/кг), чем рутин (100 мг/кг) подавляет развитие гранулемы. По сравнению со смесью флавоноидов из календулы смесь флавоноидов из бинерции обладает выраженным противовоспалительным действием на экссудативный перитонит у мышей в 5-10 раз меньших дозах. Смесь флавоноидов из бинерции в дозе 10 мг/кг статически достоверно подавляет развитие эксудативного плеврита у крыс. Календула в этой и выше дозе не оказывает достоверного влияния на развитие плеврита. На модели хронического полиферативного воспаления (Pellet-гранулема) смесь флавоноидов из бинерции по противовоспалительному действию на гранулему приближается к календуле, но активна в 2 раза меньших дозах. Смесь флавоноидов бинерции при пероральном введении практически нетоксична, МПД больше 7500. Таким образом, предлагаемый способ по сравнению с известным позволяет получить смесь флавоноидов, обладающую более ярко выраженной противовоспалительной активностью.

Формула изобретения

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СМЕСИ ФЛАВОНОИДОВ С ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНОЙ АКТИВНОСТЬЮ путем экстракции растительного сырья метанолом, упаривания экстракта до сухого остатка и очистки хроматографированием на колонке с полиамидным сорбентом, отличающийся тем, что, с целью повышения противовоспалительной активности целевого продукта, в качестве сырья используют надземную часть бинерции окружнокрылой (Bienertia cycloptera Bge), перед экстракцией растительное сырье обезжиривают хлороформом, а перед очисткой на полиамидном сорбенте сухой остаток растворяют в воде, промывают эфиром и обрабатывают бутанолом.