Способ определения @ -оксиаминокислот и их @ -замещенных производных

 

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ э1-ОКСИАМИНОКИСЛОТ И ИХ N-ЗАМЕЩЕННЫХ ПРОИЗВОДНЫХ путем окисления анализируемой пробы раствором периодата щелочного металла в присутствии щелочного агента с последующим титрованием продуктов окисления амплификационным методом и расчетом содержания анализируемого вещества, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности способа,в качестве раствора периодата щелочного металла используют 0,0250 ,05 М раствор периодата натрия, в качестве щелочного агента - 0,1-1 М раствор гидрооксида натрия и окисление проводят в присутствии рутена (Л та калия в течение 60-120 мин при 18-25 для об -оксиаминокислот и в С течение 30-80 мин при 45-55 С для их N-замещенных производных. S сл 00 со

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК ш G 01 N 31/16

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н ABTQPCHQMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 3611436/23-04 (22) 29.06.83 (46) 30.07.84. Бюл. № 28 (72) В.Я. Захаранс, Ю.P. Лаурс, И.Г. Вейнберга, Я.A. Вингрите и П.К. Норкус (53) 543. 24 (088.8)

L. Maros, д. PorI — MoInar, Е. $с)ш?еЕ. — Best immung von Serin

und Threonin uber die bei der Oxydation mit Perjodat gebildeten AIdehyde und Ammoniak. "AnnaIes universitatis scientiarum budapestinensis

de RoIando Eatvos. Sectio chimica", 1960, t. 2, рр. 237-242.

2. 3.L. AI-ZamiI, M.А. AI-Haj 1аj.i, А.И. Aziz — AIrahman. — An indirect

PoIarographic Method for the Determination of Periodate Oxidizable .Organic Compounds. "AnaIyticaI

Lettres.: Part А — ChemicaI AnaIysis", 1982, voI. 15, N AIo, рр. 831-840.

3. А. Besada. 3.А. Gawargious.

3odometric Submicro Determination

of с — Amino — AIcohoIs by an

AmpIification Reaction. "TaIanta

1974, voI. 21, № 12, рр. 1247-1252 (прототип)...SU„„1105813 А (54) (57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ d-ОКСИАИИНОКИСЛОТ И ИХ N-ЗАИЕЩЕННЫХ ПРОИЗВОДНЫХ путем окисления анализируемой пробы раствором периодата щелочного металла в присутствии щелочного агента с последующим титрованием продуктов окисления амплификационным методом и расчетом содержания анализируемого вещества, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности способа,в качестве раствора периодата щелочного металла используют 0,0250,05 M раствор периодата натрия, в качестве щелочного агента - 0,1-1 М раствор гидрооксида натрия и окисление проводят в присутствии рутената калия в течение 60-120 мин при

18-25 для с(-оксиаминокислот и в о течение 30-80 мин при 45-55 С для их N-замещенных производных.

Ф с

1 1105

Изобретение относится к органическому функциональному анализу, а именно к способам количественного определения с -оксиаминокислот (серина и треонина) и их N-замещенных производных (N-ацетил и N-трет

-бутоксикарбонил), которые применяются в пептидном синтезе, медицине, биохимии и других о-.раслях.

Известен метод определения о -ок- 1

10 сиаминокислот, основанный на окислении периодатом о -оксиаминной группировки. Окисление проводят

3"10 мин в щелочной среде, затем бО мин в уксусно-кислой среде, после чего избыток периодата восстанавливают до йодата прибавлением йодида калия в бикарбонатной среде, выделившийся при этом йод определяют титрованием раствором арсенита натрия.

Формальдегид, образующийся при окислении серина, и ацетальдегид, образующийся при окислении треонина, определяют путем их превращения в соответствующие бисульфитные соедине25 ния и косвенного йодометрического определения последних цианидным способом. Аммиак, образующийся при окислении серина и треонина, определяют путем его перегонки в дистиллированную воду и последующего опреде30 ления ацидиметрическим титрованием в присутствии метилового красного как инди кат ор а

Недостатками способа являются трудность стехиометрического осуществления реакций, необходимость применения либо арсенита натрия, либо цианида калия, либо использование перегонки для определения аммиака.

Кроме того, этот способ неприменим

40 для определения N-замещенных производных <4 -оксиаминокислот.

Известен также способ количественного определения оЕ -оксиамино- 45 кислот, основанный на их окислении взятым в избытке периодатом, с последующим определением образующихся при этом альдегидов косвенным полярографическим способом (2 ).

Недостатками этого способа являются сложность проведения определений (необходимо точно соблюдать продолжительность окисления в 1 мин, а также осуществить косвенное определе-55 ние альдегидов), а также сложность и дороговизна аппаратуры. Кроме того, этот способ неприменим для опреде813

2 ления N— - замещенных производных о -оксиаминокислот .

Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому результату является способ, основанный на окислении пробы взятым в избытке периодатом калия.

Способ заключается в помещении 0,51,5 мл 0,017-ного раствора с1-оксиаминокислоты или 50-150 мкг ее анализируемого образца в коническую колбу емкостью 50 мл, прибавлении

5 мл 0,02 н, раствора бикарбоната калия, 1 мл 0,014 М раствора периодата калия и выдерживании смеси в течение 1 мин. Затем проводят титрование амплификационным методом.

Для этого к содержимому колбы прибавляют 3,5 мл ацетатного буферного раствора с рН 2,2, 3,5 мл 25Х-ного раствора молибдата аммония, Прибли- . зительно 25 мг йодида калия, перемешивают 1 мин, после чего титруют стандартизированным 0,002 М раствором тиосульфата натрия с использованием раствора крахмала в качестве индикатора (3 3.

Недостатками способа являются сложност ь проведения опр еделений (необходимо точное соблюдение продолжительности окисления в 1 мин) и получение несколько завышенных результатов, глиоксиловая кислота взаимодействует с периодатом.

Кроме того, этот способ не дает достоверных результатов при определении N-замещенных производных o(—

-оксиаминокислот, Цель изобретения — повьш ение чувствительности способа.

Поставленная цель достигается способом, заключающимся в окислении анализируемой пробы раствором периодата щелочного металла в присутствии щелочного агента с последующим титрованием продуктов окисления амплификационным методом и расчетом содержания анализируемого вещества, при этом в качестве раствора периодата щелочного металла используют 0,025-0,05 М раствор периодата натрия, в качестве щело ного агента — 0,1-1 И раствор гидрооксида натрия и окисление проводят в присутствии рутената калия в течение бО-120 мин при 18-25ОС для

cL-оксиаминокислот и в течение 3080 мин при 45-55 С для их N-замео щенных производных.

1105813

В щелочной среде рутенат катализирует быстрое и количественное окисление периодатом формальдегида и ацетальдегида до формиата и ацетата соответственно. 5

Количество образовавшегося йодата в условиях определения строго эквивалентно количеству имевшихся с -оксиаминокислот или их N-замещенных производных, что придает достоверность получаемым результатам.

Кроме того, 1 моль d -оксиаминокислоты или ее N-замешенного производного реагирует с 3 моль периодата с образованием 3 моль йодата, 15 что эквивалентно 9 моль трийодида, на титрование которого расходуется

18 r-экв тиосульфата натрйя, т.е. чувствительность способа повышается в 3 раза.

Предлагаемый способ заключается в следующем.

Навеску определяемой с -оксиаминокислоты или ее N-замещенного производного величиной 2-15 мг (или аликвотную часть раствора в дистиллированной воде величиной 5 мл, содержащую такое же количество определяемого соединения) растворяют в 5 мп дистиллированной воды, при- ЗО бавляют 10-20 мл 0,025-0,05 M раствора периодата натрия в воде, 25 мл

О, !-1 М раствора гидрооксида натрия, О,i мл 0,01 М раствора рутената калия в О, 1 н. растворе гидроксида натрия и окисляют в течение 60-120 мин при комнатнбй температуре в случае с -оксиаминокислот (серина и треонина), в течение 30-50 мин при 45-55 С в случае N-трет -бутоксикарбонилзамещен- 40 ных производных о -оксиаминокислот и в течение 60-80 мин при 45-55 С в случае N-ацетилзамещенных производных Ы-оксиаминокислот. Затем в реакционную смесь вводят 25 мл 6 М 45 раствора уксусной кислоты, 10 мл

1 N раствора молибдата натрия или аммония, хорошо перемешивают содержимое стаканчика для титрования, прибавляют 5 мл 20%-ного раствора йодида калия и при перемешивании титруют 0,025-0, 1 н. стандартизированным раствором тиосульфата натрия в присутствии 0,5%-ного водного раствора крахмала как индикатора, прибавляемого к концу титрования, до исчезновения сине †розов окраски раствора. Параллельно проводят холостой опыт (без навески Ы -оксиаминокислоты или ее N-замещенного производного) .

Содержание с -оксиаминокислоты или ее N-замещенного производного вычисляют по формуле:

Х (Vq — V ) М N где V„объем стандартизированного раствора тиосульфата натрия, израсходованный на титрование в анализе, мп, V — объем стандартизированного раствора тиосульфата нат" рия, израсходованный на титрование в холостом опыте, мл;

M - молекулярная масса определяемой с -оксиаминокислоты или ее И-замещенного производного;

N — концентрация стандартизиров нного раствора тиосульфата натрия,г-экв/л; — навеска определяемого соединения, мг.

При снижении температуры окисления замедляется скорость проходящих реакций, а при ее повышении реакции ускоряются, однако на кривых образования йодата в зависимости от продолжительности окисления не выявляются прямолинейные участки, соответствующие стехиометрическому осуществлению этих реакций, а наблюдается нарушение их стехиометрии в сторону завышения.

То же самое наблюдается и при отклонении от указанных концентраций периодата натрия и гидроксида натрия.

Пример 1. Количественное определение L-серпна.

В стаканчик для титрования емкостью 250 мл помещают навеску препарата, равную 4,815 мг, и растворяют в 5 мл дистиллированной воды. К полученному раствору прибавляют 10 мл 0,05 М раствора периодата натрия, 25 мл О, 1 M раствора гидроксида натрия и О,1 мл 0,0135 М раствора рутената калия в 0,1 н ° растворе гидроксида натрия, перемешивают содержимое стаканчика и оставляют на 120 мин при 18 С в защищенном от прямого солнечного света месте. Потом прибавляют 25 мл 6М раствора уксусной кислоты, 10 мл

05813

= 98,57.

25 (14,15-1,38) 119 12

18 -3,782

Определено 3,782 мг D,L-треонина с точностью 0,97.

Пример 3. Количественное оп35 ределение D, L "тр еонина.

В стаканчик для титрования емкостью 250 .мл помещают навеску препарата, равную 4,345 мг, и растворяют в 5 мл дистиллированной воды.

К полученному раствору прибавля1от

20 мл 0,025 M раствора периодата натрия, 25 мл 1 И раствора гидроксида натрия и 0,1 мл 0,0135 M раствора рутената калия, перемешивают со- 45 держимое стаканчика и оставляют на

90 мин при 21 С в защищенном от прямого солнечного света месте.

Потом прибавляют 25 мл 6 И раствора

40 (16 71-2,02) 1I9 12 0

18.4, 345

Определено 4,345 мл D,L-треонина с точностью О, 77.

Пример 4. Количественное определение N-тре т -бутоксикар бо55 нил-L-серина.

В стаканчик для титрования емкостью 250 мл помещают навеску пре- /.100% = 99,87

5 11

1 И раствора молибдата натрия и тщательно перемешивают содержимое стаканчика. Наконец, прибавляют

5 мл 207-ного раствора йодида калия и при перемешивании титруют 0,0446 н. раствором тиосульфата натрия. К концу титрования прибавляют 0,5 мл

0,57.-ного раствора крахмала и продолжают титровать до исчезновения сине-розовой окраски раствора.

Расход титранта (V ) составляет

20, 22 мл.

Холостой опыт (без навески

L-серина) проводят аналогично.

Расход титанта (V, ) составляет

2,01 мл.

Содержание L-серина вычисляют по формуле: (20 22-2,01):105,09 0,0446 100718.4, 815

Определено 4,815 г L-серина с точностью О,б .

Пример 2. Количественное определение D,L-треонина, В стаканчик для титрования емкостью 250 мл помещают навеску

20 препатата, равную 3,782 мг, и растворяют в 5 мл дистиллированной воды.

К полученному раствору прибавляют

20 мл 0,025 M раствора периодата натрия, 25 мл 1 M раствора гидроксида натрия и 0,1 мл 0,0135 М раствора рутената калия в О, 1 н. растворе гидроксида натрия, перемешивают содержимое стаканчика и оставляют на

60 мин при 25 С в защищенном от прямого солнечного света месте.

Потом прибавляют 25 мл 6 М раствора уксусной кислоты, 10 мл 1 М раствора молибдата натрия и тщательно перемешивают содержимое стаканчика. Наконец, прибавляют 5 мл 207-ного раствора йодида калия и при перемешивании титруют 0,0446 н. раствором тиосульфата натрия. К концу титроваеия прибавляют 0,5 мл 0,57-ного раствора крахмала и продолжают титровать до исчезновения сине-розовой окраски раствора ° Расход титранта составляет 14,15 мл.

Холостой опыт проводят аналогично. Расход титранта составляет

1,38 мл, По формуле вычисляют содержание

D,L-треонина:

0,0446

1007 = 99,67. уксусной кислоты, 10 мл 1 M раствора молибдата натрия и тщательно перемешивают содержимое стаканчика. Наконец, прибавляют 5 мл 207-ного раствора йодида калия и при перемешива" нии титруют 0,0446 н. раствором тиосульфата натрия. К концу титрования прибавляют 0,5 мл 0,57-ного раствора крахмала и продолжают титровать до исчезновения сине-розовой окраски раствора. Расход титранта составляет 16,7 1 мл.

Холостой опыт проводят аналогично. Расход титранта составляет

2,02 мл.

По формуле вычисляют содержание

В, L-треонина: парата, равную 5,4ОО мг, и растворяют в 5 мл дистиллированной воды.

К полученному раствору прибавляют

10 мл 0,05 М раствора периодата натрия, 25 мл 0,2 М раствора гидроксида натрия и 0,! мл 0,0135 М раствора рутената калия в 0,1 н.

1105813 растворе гидроксида натрия, перемешивают содержимое стаканчика и оставляют на 30 мин при 55 С (воо дяная баня) в защищенном от прямого солнечного света месте. Потом прибав- ляют 25 мл 6 1! раствора уксусной кислоты, 10 мл 1 M раствора молибдата аммония и тщательно перемешивают содержимое стаканчика. Наконец, прибавляют 5 мл 207.-ного раствоо !О йодида калия и при перемешивании титруют 0,0258 н. раствором (23,22-5,15) 205,22 0,0258 97

25 мл б М раствора уксусной кислоты, 10 мл 1 М раствора молибдата аммония и тщательно перемешивают содержимое стаканчика. Наконец, при20 бавляют 5 мл 207-ного раствора йодида калия и при перемешивании титруют 0,0982 н. раствором тиосульфата натрия. К концу титрования прибавляют 0,5 мл 0,57.-ного раствора крахмала и продолжают титровать до исчезновения сине-розовой окраски раствора. Расход титранта тавляет 14,22 мл..

30 Холостой опыт проводят аналогично. Расход титранта составляет

1,85 мл.

По формуле вычисляют содержание

Ы-трет -бутоксикарбонил-L-серина:

22 О 0982 1007. = 97,57 света месте. Потом прибавляют 25 мп б M раствора уксусной кислоты.!О мл

40 И раствора молибдата йятрия и тщательно перемешивают содержимое стаканчика. Наконец, приб-пйтяют 5 мл

207-ного раствора йодида калия и при перемешивании титруют."0,0534 н.

45 раствором тиосульфата на грия. К концу титрования прибавляют 0,5 мл

0,57-ного раствора крахмала и продолжают титровать до исчезновения сине-розовой окраски раствора. Расход титранта составляет 14,42 мл. (14,42-3,30) -171, 14-0 0534 !О

18-6,170

Определено 5,480 мг N-трет -бутоксикарбонил-L ñåðèíà с точностью

1, 27.

Пример 5. Количественное определение !-трет -бутоксикарбонил-L-серина.

В стаканчик для титрования емкостью 250 мл помещают навеску препарата, равную 14,20 мг, и растворяют в 5 мл дистиллированной воды.

К полученному раствору прибавляют

20 мл 0,5 M раствора гидроокиси натрия и О, 1 мл 0,0135 М раствора рутената калия в 0,1 н. растворе гидроксида натрия, перемешивают содержимое стаканчика и оставляют на 50 мин при 45 С (водяная баня) в защищенном от прямого солнечного света месте. Потом прибавляют (14,22-1,85). 205

18 14,20

Определено 14,20 мг N-трет -бутоксикарбонил-L-серина с точностью

1, 07..

Пример 6. Количественное определение натриевой соли N-ацетил-D,L-серина. Опытная партия !! 8 °

В стаканчик для титрования емкостью 250 мл помещают навеску препарата, равную 6,170 мг, и растворяют в 5 мл дистиллированной воды.

К полученному раствору прибавляют

10 мл 0,05 M раствора периодата натрия, 25 мл О, 1 M раствора гидроксида натрия и О, 1 мл 0,0135 M раствора рутената калия в 0,1 н. растворе гидроксида натрия, перемешивают содержимое стаканчика и оставляют на

60 мин при 55 С (водяная баня) в защищенном от прямого солнечного тиосульфата натрия. К концу титрования прибавляют 0,5 мл 0,57-ного раствора крахмала и продолжают титровать до исчезновения синерозовой окраски раствора. Расход титранта составляет 23,22 мл.

Холостой опыт проводят аналогично. Расход титранта составляет

5,!5 мл.

По формуле вычисляют содержание N-трет -бутоксикарбонил-L-серина:

Холостой опыт проводят аналогично. Расход титранта составляет

3,30 мл.

По формуле вычисляют содержание натриевой соли N-ацетил-D,L-серина:

11058 13

1007. = 43,27..

Составитель В. Шкилькова

Редактор М. Циткина Техред C.Ìèãóíoâà Корректор М. Шароши

Заказ 5594/35

Тираж 823 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035,Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4

Таким образом, опытная партия

9 8 натриевой соли N-ацетил-D,Ь"серика содержит 91,57 основного вещества (погрешность 1,27).

Пример 7. Количественное определение натриевой соли N-ацетил-D L-серина, Опытная партия Н 15.

В стаканчик для титрования емкостью 250 мл помещают навеску препарата, равную 12,36 мг, и раство10 ряют в 5 мл дистиллированной воды. К полученному раствору 1трибавляют

10 мл 0,05 И раствора нериодата натрия, 25 мл 0,1 И раствора гидрокснда натрия и Ор1 мл 0 0135 И раствора рутената калия в О, 1 н. растворе гидроксида натрия, перемешивают содержимое стаканчика и оставляют на

80 мин при 45 С (водная баня) в

2О х (16,05"5 55) 171 14

Ф.- 12, 36

Таким образом, опытн я партия

Р 15 натриевой соли N-адетил-D L!

-серина содержит 43,27 основного ве" щества (погрешность 1,57) .

Предлагаемый способ дает достоверные и точкые результаты: относительное сТандартное отклонение, харак"0 теризующее точность метода 0,5-1,57. защишекном от прямого солнечного света месте. Потом прибавляют

25 мл 6 М раствора уксусной кислоты, 10 мл 1 М раствора молибдата натрия и тщательно перемешивают содержимое стаканчика. Иаконец, при бавляют

5 мл 207.-нога раствора йодида калия и при перемешивании титруют 0,0534 н. раствором тносульфата натрия. К концу титрования прибавляют 0,5 мл

0,57-ного раствора крахмала и продолжают титровать до исчезновения сине-розовой окраски раствора. Расход титранта составляет 16,05 мл.

Холостой опыт проводят аналогично. .Расход титранта составляет 5,55 мл.

Ilo формуле вычисляют содержание натриевой соли N-ацетил-D,L-серика:

Чувствытазикасть способа повышена в

3 разя. Определению N"ацетилпроизводКых о!-оксиаминокислот предлагаемым способом не мешает присутствие ацетата. Таким образом, предлагаемый способ позволяет просто и эффективно контролировать технологический процесс получения N-замещекных производных 4 -оксиаминокислот.