Способ подбора донора при трансплантации трупных тканей опорно-двигательного аппарата

 

СПОСОБ ПОДБОРА ДОНОРА ПРИ ТРАНСПЛАНТАЦИИ ТРУПНЫХ ТКАНЕЙ ОПОРНОДВИГАТЕЛЬНОГО АППАРАТА путем определения in vitro властной трансформации лимфицитов периферической крови реципиента на трансплантационные антигены донора, отличающийс я .тем, что, с целью повышения точности способа и сокращения времени селекции, дополнительно определяют макрофагальную трансформацию мононуклеаров. (Л

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

3(59 А 61 К 39/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТ

К ABTOPCH0MV СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Ю

СЬ

Сл

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И OTHPblTMA (21) 2841698/28-13 (22) 23. 11. 79 (46) 07. 08. 84. Бюл. Ф 29 (72) Л.И. Гусева, Г.М. Дизик и Л.М. Окунева (71) Киевский научно-исследовательский институт ортопедии (53) 615.373(088.8) (56) 1. Зотиков Е.А. и др. Получение, хранение И применение тестовых реактивов для тканевого типирования при аллогенных трансплантациях и гемотрансфузиях. — "Лабораторное дело",.

1976, Р 10, с, 630-638.

2. Bach F.Н., Voynow N.Ê. One way

stimulation in mixed leucocyte cultuгез Scince, 1966, 153, 545 — 547.

„SU„„1106508 (54) (57) СПОСОБ ПОДБОРА ДОНОРА ПРИ

ТРАНСПЛАНТАЦИИ ТРУПНЫХ ТКАНЕЙ ОПОРНОДВИГАТЕЛЬНОГО АППАРАТА путем определе. ния in vitro бластной трансформации лимфицитов периферической крови реципиента на трансплантационные антигены донора, отличающийся,тем, что, с целью повышения точности способа и сокращения времени селекции, дополнительно определяют макрофагальную трансформацию мононуклеаров.

Для селекции донора используется принцип однонаправленной СКЛ, где в качестве стимулирующего агента используется лизат лимфоцитов.донора— трупа, полученный однократным замора 0 живанием лимфоцитов при -25 — (-35) С без протектора в течение 1 - 12 мес. и однократным оттаиванием при комнатной температуре в течение 1 ч. Селекция донора проводится на основании учета бластной и макрофагальной транс. формации лимфоцитов периферической крови реципиента, 1 1106

Изобретение относится к медицине, преимущественно к трансплантационной иммунологии, и предназначено для селекции донора при трансплантации трупной, в частности костной ткани.

Известен способ подбора донора по антигенам гистосовместимости при .. пересадке органов и тканей - серологическое типирование при помощи типируемых моноспецифических сывороток (.13.

Однако данный способ требует дорогостоящих моноспецифических сывороток.

Известен способ подбора донора при трансплантации трупных тканей опорно-двигательного аппарата путем определения in vitro бластной транс. формации лимфоцитов периферической крови реципиента, при этом используется однонаправленная смешанная культура лимфоцитои (СКЛ), где лимфоциты донора обрабатываются митомицином С или облучается, что делает их неспособными трансформироваться в бласты (2 ).

Однако известный способ менее точен, а кроме того, возможное получение результатов реакции достигается только на 7 сут.

Цель изобретения — повышение точности способа и сокращение времени селекции.

Указанная цель достигается тем, что согласно способу подбора донора при трансплантации трупных тканей опорно-двигательного аппарата путем определения in vitro бластной трансформации лимфоцитов периферической крови реципиента на трансплантационные антигены донора, дополнительно определяют макрофагальную трансформацию мононуклеаров.

Способ осуществляется следующим образом.

508 2

Пример t. Фибринолизную кровь берут из сердца трупа до забора костной ткани в асептических условиях.

Для получения лимфодитарной суспензии из трупной крови эритроциты осаждают

57 раствором желатина (на среде 199), которую добавляют в соотношении 1:2.

Пробирки помещают под углом 45 на

40 мин при комнатной температуре, надосадочный слой снимают. Для осаждения лимфоцитов надосадок центрифугируют при 180 q 10 мин, к осадку добавляют для лизиса эритроциты 0,847 раствора хлористого аммония выдерживают при +4 С 5 мин, с последующим центрифугированием при 180 q

8 мин. К осадку добавляют 6 — 8 мл среды 199„ повторно центрифугируют

180 q 10 минут, полученный осадок ресуспендируют в среде 199, проводят подсчет лимфецитарных клеток в 1 мл в световом микроскопе в камере Горячева при увеличении в 200 раз (для обеспечения в дальнейшем оптимального соотношения стимулирующего агента

"отвечающих" клеток).

Полученную суспензию помещают в холодильную камеру при температуре

-25 С -35 С на срок 1 — 12 мес. до момента селекции донора и трансплантации кост1 ой ткани. Замораживание и хранение лимфоцитарной суспензии проводят в запаянных ампулах, все манипуляции — в стерильных условиях.

Кровь реципиента берут из локтевой вены натощак, 20,0 мл на гепарине. В дальнейшем возможна постановка СКЛ с чистой лимфоцитарной суспензией реципиента, либо с его цельной кровью.

В первом случае выделение лимфоцитов проводят по описанной методике. Во втором случае — в пробирки помещают цельную кровь в количестве 0,2

0,3 мл с подсчетом содержащихся в этом количестве лимфоцитов.

Б пробирки с культуральной средой (среда 199, Мгла, Зенкса) и аллогенной

АВ (1У) или ксеногенной (бычьей, телячьей, лошадиной сывороткой) помещают лимфоциты (кровь) реципиента и лизат лимфоцитов донора в пересчете на клетки в соотношении 1:3, культивируют культуру 72 ч при температуре о

37 С. Параллельно ставят контроль (содержащий только клетки реципиента) и реакцию с фитогемагглютинином, Учет — морфологический — подсчитывается процент бластов и микрофагов в каждой культуре (окраска по Рома1106508

Процент трансформированных клеток в СКЛ

Контроль (нестимулированная культура) Реакция с фитогемагглютиДонор нином

А(11) А(3 Х) 0(I) А(1Х) Блас-. Макро- Блас- Макро- Блас- Мак- Влас- Мак. ты фаги ты фаги ты рофа- ты роги фаги

Блас- Макроты фаги

Макрофаги

Бласты

49 2

13 новскому, считается 300 клеток). Реакция ставится одновременно с несколькими донорскими образцами после того, как клиницист произвел отбор приемлемых трансплантатов от трупов — доно- 5 ров из банка консервирования по рент-геновскому снимку и группам крови.

В предлагаемом способе культивируют лимфоциты 72 ч, а в аналогах—

168 ч, что сокращает время исследования на 96 ч. Применение предлагаемого способа не предусматривает сохранение жизнеспособности лимфоцитов донора и поэтому не требует дорогостоящей аппаратуры для программного их замора- 15 живания, что удешевляет и упрощает процесс селекции. Учет степени не только бластной трансформации клеток, но и макрофагальной трансформации— вводит дополнительный показатель для 20 оценки совместимости, что повышает точность селекции донора, так как микрофаги являются необходимым звеном в иммунном ответе. Способ пригоден при трансплантации трупной костной ткани, которая по существующему поПри селекции рекомендовано использовать для трансплантации костную ткань от донора 1, с которым в СКЧ минимальная реакция, и не использовать ткани донора 2, давшего максимальную и макрофагальную реакцию.

Результаты учета.

В нестимулированной культуре лимфоцитов (без добавления донорского антигена) бластов 1%, макрофагов 11Ж).

Эта реакция служит контролем при дальложению пересаживается в замороженном состоянии не ранее, чем через один месяц с момента заготовки.

Способ может быть использован для изучения трансплантационного иммунитета в динамике после аллотрансплантации, так как хранение донорских лимфоцитарных лизатов не представляет трудности. Способ апробирован на

58 образцах крови, из них 50 доноров, 5 реципиентов, 3 клинически здоровых лица (контроль).

Пример 2. Больной Щ., диагноз: хронический остеомиелит проксимального отдела правой бедренной кости в стадии ремиссии, сгибательная

KoHTpaKTvDa в тазобедренном суставе, история болезни N- 327233, группа кро ви А (1T), резус положительный.

Определены клинические показания к трансплантации костной ткани. Проведена селекция донора для реципиента Щ. по предлагаемому способу, ре- зультаты которой представлены в таблице.

5 45 5 17 3 20 нейшей селекции донора, как начальная точка отсчета. При реакции с фитогемагглютинином бластов 49%, макрофагов 2%, реакция показывает, что реак-. тивность лимфоцитов больного по отношению к митогену снижена. При реакции с лизатом лимфоцитов донора 1, группы крови 0 (7), бластная реакция 1%, макрофагов 13%, отнимаем эти показатели от контрольных — результат указывает, что в этом случае бластной реакции

5 1106508 нет, а макрофагов — 27.. При реакции с донором 2, группа крови A(II), бластов 57, макрофагов 457, отнимаем контрольные значения, т.е. в нестимулированнои донорскими антигенами куль- 5 туре лимфоцитов, в результате: бластная реакция 4Х, макрофагальная реаг,— ция 34Х. При реакции с донором 3, группа крови А (1Т), бластов 57, макрофагов 17Х, после сопоставления с 10 контролем : бластов 4Х, макрофагов

6Х, При реакции с донором 4, группа крови A(II), бластов 37, макрофагов

20Х, после сопоставЛения с контролем: бластов 2Х, макрофагов 9Х, 15

Наименьшую бластную и макрофагальную реакции дает донор 1, вследствие чего он и рекомендован для данного реципиента.

Наибольшую макрофагальную реакцию 20 дает донор Р 2, почему он должен быть отклонен. 5 случае, если бы проводился выбор между донорами 2 и 3,давшими одинаковую бластную реакцию 4Х, то предпочтение имеет донор 3, с которым 25 макрофагальная реакция меньшая — 67., а не донор 2, с которым макрофагальная реакция 347.. Таким образом, учет макрофагальной реакции повышает в два раза точность селекции донора. 30

Повышение точности селекции достигается тем,что среди доноров, давших одинаковую бластную реакцию, по макрофагальной трансформации можно выбрать более совместимого на основе подсчета количества макрофагов. Тот донор, который при равной бластной дает наименьшую макрофагальную реакцию будет наиболее совместимым. Сокращение времени селекции достигается тем, что вместо 7 сут н известном способе культивирование клеток производится в предлагаемом способе 3 сут в связи с тем, что макрофаги из мононуклеаров трансформируются раньше, чем бласты из лимфоцитов и максимальная трансформация макрофагов наблюдается через 72 ч. Большое количество макрофагов по сравнению с ничтожно малым количеством бластов, например 45 макрофагов по сравнению C 7 бластами, подсчитывается значительно легче под микроскопом, а вариабельность колеблется в диапазоне 2 — 45 при макрофагальной трансформации, в пределах

2 — 7 для бластной трансформации.

Точность способа обеспечивается также и тем, что при бластной трансформации встречаются переходные формы клеток, имеющие признаки общие для большого лимфоцита и малого бласта, например большое ядро, но без ядрышек внутри него, небольшой ободок цитоппазмы и др., что затрудняет классификацию клеток. При оценке макрофагальной трансформации эта трудность не возникает,так как макрофаг на любой стадии трансформации имеет признаки, характерные только для этого вида клеток: эксцентрично расположительное ядро, пенистую цито" плазму, в которой имеется вакуоли и . включения (фагоцитированные частицы).!

Тираж 688 Подписное

ННИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Заказ 5656/3

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Составитель Г. Крюкова

Редактор И. Дербак Техред Т.Фанта Корректор M. Демчик