Способ выделения рнк-зависимой днк-полимеразы

 

СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ РНК-ЗАВИСИМОЙ ДНК-ПОЛИМЕРАЗЫ ИЗ вируса птичьего миелобластоза путем обработки вирусной суспензии лизирующей смесью с последующим центрифугированием и хроматографией раствора на фосфоделлюлозе Р-П и аффинной хроматографией на гепарин-сефарозе, отличающийся тем, что, с целью повышения активности вьщеляемого фермента и его стабильности, после хроматографии на фрсфоцеллюлозе осуществляют диализ с предварительной обработкой диализного мешка бычьим сывороточным альбумином в концентрации 1-2 мг/мл в течение 5-10 мин, а весь процесс выделения ведут в условиях калийфосфатного (Л буфера при рН 7,8-8,0.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (19) (11) З(51) С 12 N 9/14

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

flO ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ

К ABTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 3480631/28-13 (22) 05. 08. 82 (46) 15.08.84. Бюл. Р 30 (72) 10.В.Ремнев, Е.И.Самохвалов, В.П,Юферов, Л.В.Урываев, П.В.Бабаева и P.В.Боровик (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт прикладной микробиологии (53) 577.15 (088.8) (56) 1. "Analytical Biochemistry, 1979, v.101, р,89.

2.М.6о1отЬ, Э.Р. Сгап) цепей, Endonucleose Activity of Purified

RNA-directed DNA Polymerase from

Avian Муе1оЬ1ая fosis virus.—

Ч ° Biological Chemistry", 1978, v.254, Р 5, 1006-1615. (54) (57) СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ PHK-ЗАВИСИМОЙ ДНК-ПОЛИМЕРАЗЫ из вируса птичьего миелобластоза путем обработки вирусной суспензии лизирующей смесью с последующим центрифугированием и хроматографией раствора на фосфоцеллюлозе P-П и аффинной хроматографией на гепарин-сефарозе, о т л и ч а ю щ и. и с я тем, что, с целью повышения активности выделяемого фермента и его стабильности, после хроматографии на фосфоцеллюлозе осуществляют диализ с предварительной обработкой диализного мешка бычьим сывороточным альбумином в концентрации 1-2 мг/мл в течение

5-10 мин, а весь процесс выделения ведут в условиях калийфоефатного буфера при рН 7,8-8,0.

1108105

Изобретение относится к биологической химии и может быть использовано для выделения и очистки РНК-зависимой ДНК-полимеразы (ревертазы) из вируса птичьего миелобластоза.

Известны различные способы выделения фермента ревертазы, основанные на применении ионообменных смол и комбинации из различных методов очистки.

Известен способ выделения ревертазы из вируса птичьего миелобластоза, основанный на ионообменной хроматографии в градиенте концентрации глицерина Ll.

Однако длительность многостадийной процедуры выделения для получения препарата высокой степени очистки приводит к потерям фермента в результате его инактивации; полученный фермент на конечной стадии имеет низкую удельную активность в результате разбавления и поэтому требуется дополнительно вводить процедуру концентрирования фермента, что . также приводит к снижению общего количества ферментного препарата.

Наличие нуклеазных примесей не поз воляет использовать весь.пик ферментативной активности, поэтому приходится отбирать только зону фермента, свободную от нуклеазных загрязнений, что приводит к уменьшению выхода фермента.

Известен способ выделения данного фермента из вируса птичьего миелобластоэа путем обработки вирусной суспензии лизирующей смесью с последующим центрифугированием и хромато10

35 графией раствора в К-фосфатном буфере (рН 8,0) на ионообменной смоле

ДЕЛЕ-52, фосфоцеллюлозе Р-П с после- 40 дующей очисткой аффинной хроматографией на гепарин-сефарозе в условиях трис-НС1 буфера (рН 7 5) и хроматографией на поли-С-сефарозе, поли-У-сефароэе и в градиенте концент- 45 рации глицерина .27.

Известный способ рассчитан на выделение фермента лишь в аналитических количествах и для получения коммерческого препарата непригоден в связи с большими потерями в процессе выделения фермента и большой трудоемкостью способа. Резкое паде; ние общей ферментативной активности при переходе от стадии очистки на фосфоцеллюлозе Р-11 к гепарин-сефарозе и при длительном хранении препарата обусловлено использованием на стадии очистки фермента на гепарин-сефарозе 4В буферного раствора на основе трис-нС1 (рН 7,5), в то 60 время как фермент находится в калийфосфатном буфере (рН 8,0) .

Целью изобретения является повышение активности выделяемого фермента и его стабильности. 65

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу выделения

PHK-зависимой ДНК-полимеразы (ревертазы) из вируса птичьего миелобластоза путем обработки вирусной суспенэии лиэирующей смесью с последующим центрифугированием и хроматографией раствора на фосфоцеллюлозе Р-П и аффинной хроматографией на гепарин сефарозе, после хроматографии на фосфоцеллюлозе осуществляют диалиэ с предварительной обработкой диалиэного мешка бычьим сывороточным альбумином в концентрации 1-2 мг/мл в течение 5-10 мин, а весь процесс выделения ведут в условиях калийфосфатного буфера при рН 7,8-8,0.

Для получения фермента достаточ-. но использовать ионообменную хроматографию на гепарин-сефароэе 4В и ионообменную хроматографию на фосфоцеллюлоэе, выделение фермента проводится на всех стадиях в калийфосфатном буфере при рН 8,0-7,8. Все это приводит к увеличению активности фермента, значительному повышению выхода реверта зы на конечной стадии очистки и стабильности ферментного препарата при сроке хранения . мес.

Проведение диализа между ионообменной хроматографией на фосфоцеллюлоэе P-П и аффинной хроматографией на гепарин-сефарозе 4В, перед которым осуществляют обработку диализного мешка раствором бычьего сывороточного альбумина в концентрации 1-2 мг/мл в течение 10 мин,приводит к тому, что молекулы бычьего сывороточного альбумина связываются с поверхностью диализной мембраны и создают биологически аинертную поверхность, которая при взаимодействии с ферментом не влечет эа собой его инактивацию.

Результаты 10 экспериментов по выделению ревертазы предлагаемым способом показали, что для получения препарата фермента, пригодного в работах по генной инженерии, достаточно двух стадий очистки: фосфоцеллюлоэа P-П и гепарин-сефароэа 4В.

Полученный препарат обладает достаточной концентрацией, пригодной для проведения реакции обратной транскрипции, нуклеазная активность отсутствует. При электрофорезе в

103-ном полиакриламинном геле в денатурирующих условиях фермент представлен двумя субъединицамибез посторонних примесей.

Пример 1. Проводят выделение и очистку ревертазы из вируса птичьего миелобластоза, количество вируса lб0,5 мг. Вирус в объеме

14 мл разрушают добавлением лизиру1108105

Составитель О.Скородумова

Редактор Т.Колб Техред A.À÷ Корректор Д-Мельниченко

Заказ 5838/18 Тираж 522 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб.,д.4/5

Филиал ППП патент, г.ужгород, ул.Проектная,4 ющей смеси; 1,4 мл нонидет Р-40;

1,4 мл 10%-ного раствора дезоксихолата натрия; 4,2 мл 4М раствора

КС1. Смесь инкубируют 15 мин при

О С, центрифугируют при 10 000 в течение 10 мин. Надосадочную жидкость разбавляют в 10 раз 10 мМ калийфосфатным буфером (рН 7,8), содержащим 2 мМ дитиотрейтола (ДДТ), 0,2% нонидет Р-40, 10Ъ-ного глицерина, и наносят на колонку P-П(Ват- 10 ман) размером 0,8 10 см, уравновешенную в том же буфере со скоростью

10-20 мл/ч. Колонку промывают 50 мл

50 мМ калийфосфатного буфера (рН 7,8) с теми же. добавками. Элю- >5 цию фермента проводят линейным градиентом калийфосфатного буфера от

50 до 500 мМ. Активные фракции (активность определяют по Спигельману) собирают и объединяют. Диалиэный мешок (slq uo 9 250-94) кипятят в течение 20 мин в дистиллированной воде, затем внутрь мешка помещают раствор бычьего сывороточного альбумина.

В концентрации 2 мг/мл выдерживают в течение 10 мин и мешок -промывают буферным раствором 30 мМ калийфосфатного буфера (рН 7,8); 20Ъ глицерина; 2 мМ ДДТ; 0,2Ъ нонидет

P-40. Диализ проводят в течение 2 ч против того же буфера, охлажденного до 4 С. Диализованный фермент наносят на колонку с гепарин-сефарозой

4В со скоростью 2 мл/ч элюируют линейным градиентом хлористого натрия от 50 мМ до 1000 мМ в 30 мМ калийфосфатном буфере (рН 7,8) с 20%-ным глицерином, 2 мМ ДДТ, 0,2% нонидет

P-40. Активность полученного фермента 2 ед/мкл (по Спигельману) . Общее 4() количество 10 000 ед.

Пример 2. Проводят выделение и очистку ревертазы из 65,5 мг вируса птичьего миелобластоза. К вирусной суспензии объемом 5 мл добавля- 45 ют 0,6 мл нонидет P-40, 0,6 мл

10%-ного раствора дезоксихолата нат-: рия; 1,8 мл 4 М раствора КС1. Суспензию выдерживают при 0 C в течение 15 мин, центрифугируют при

10 000 в течение 10 мин. Надосадочную жидкость разводят в 10 раэ буферным раствором 10 мМ калийфосфатным буфером (pH 8,0), 2 мМ ДДТ, 0,2Ъ нонидет Р-40, 10%-ного глицерина, наносят на Р-П, скорость нанесения 15-20 мл/ч, колонку промывают 50 мл 50 Мм калийфосфатного буфера (рН 8,0) с теми же добавками.

Элюцию ферментов проводят линейным градиентом (50-500 мМ) калийфосфатного буфера (рН 8,0) . Активные фракции собирают. Диалиэный мешок кипя:тят в течение 20 мин в дистиллированной воде, затем внутрь мешка помещают раствор бычьего сывороточного альбумина, свободного от нуклеаз в концентрации 1 мг/мл, выдерживают в течение 5-10 мин, и мешок осторожно промывают буферным раствором (30 мМ калийфосфатный буфер (pH 8,0), 20% глицерина, 2 мМ ДДТ 0,2% нонидет P-40). Активные фракции с P-П помещают в обработанный мешок и проводят диализ в течение 2 ч против того же буфера, охлажденного до 4 С.

Диализованный фермент наносят на колонку (размером 0,5 0,8 см) с гепарин-сефароэой, уравновешенную в 30 мМ калийфосфатном буфере (рН 8,0) со скоростью 2 мл/ч и элюируют линейным градиентом хлористого натрия (50

1000 MM) в 30 MM калийфосфатном буфере (рН 8,0) с 20% глицерина, 2 мМ

ДДТ, 0,2% нонидет Р-40. Активность полученного препарата 1 ед/мкл (по

Спигельману), общее количество

2500 ед.

В первом и втором примерах, фермент подвергали хранению в течение 6 мес, при этом потеря активности составила не более 20% в месяц.

Количество стадий выделения сократилбсь с 5 в прототипе до 2 в предлагаемом способе беэ снижения качества препарата. Количество выделенного фермента на конечной стадии при одинаковом количестве вируса птичьего миелобластоза в прототипе составило

3000 ед, а в предлагаемом способе

10000 ед. Сравнение физико-химических свойств препарата при электрофорезе в 10Ъ-ном полиакриламидном геле показывает, что фермент в обоих случаях представлен двумя субъединицами (аь и p ) беэ посторонних примесей.

Нуклеазная активность также отсутствует ° В процессе длительного хранения(-70 С) активность препарата, выделенного предлагаемым способом,снижается на 20Ъ в месяц, а в прототипе на 25%.