Способ получения эндонуклеазы рестрикции

 

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ РЕСТРИКЦИИ, включающий вьтращивание микроорганизма - продуцента фермента, обладаклцего-способностью узнавать и расщеплять последователь®№СОШЗ|: ДЯ / ff ;..,..f iiv:::::± nl чЧ .1 - -..lJ4, ность нуклеотидов 5СС (A/T)GG, разрушение клеток ультразвуком, фракционирование белков и очистку фермента путем хроматографии, о т л и ч. аю щ и и с я тем, что, с целью повышения выхода фермента, в качестве микроорганизма-продуцента фермента используют штамм Micrococcus varians ЦМПВ В-2661, а очистку фермента проводят на фосфоцеллюлозе Р 11 в 10 мМ калий-фосфатном буфере рН 6,57 ,1 и элюцией градиентом хлористого калия 0,3-1,2 И. 2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что штамм Microi coccus varians ЦМПМ В-2661 вьфащиko вают на питательной среде, содержащей , г/л: Пептон9,0-10,0 Дрожжевой экстракт4,5-5,5 Хпористый натрий4,5-5,0

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК (104 С 12 N 9/14, 15/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМ,Ф СВИДЕТЕЛЬСТВУ

4,5-5 0

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЬП ИЙ

-(21) 3514707/30-15 (22) 07.12.82 (46) 07 ° 09.85. Бюл. 1Ф 33 (72) Д.П.Вайткявичюс, Б.П.Яскелявичене, С.-Б.А.Пунтежис и Э.-А.А.Янулайтис (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт прикладной энзимологик (53) 577.155.2(088.8) (56) 1. Косых В.Г. и др. "Выделение, очистка и характеристика рестрикционной эндонуклазы Ecoh II". Биохимия, 1982, т. 47, с. 619-525.

2. Грачев С.А. и др. "Рестрикционная эндонуклаза Fag XI из Thermus aguaticus". Биоорганическая химия, 1981, т. 7, с. 628-630. (54)(57) 1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ РЕСТРИКЦИИ, включающий выращивание микроорганизма — продуцента фермента, обладающего способностью узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов 5 СС (А/T) GG, разрушение клеток ультразвуком, фракционирование белков и очистку фермента путем хроматографии, о т л и ч аю.шийся тем, что, с целью повышения выхода фермента, в качестве микроорганизма-продуцента фермента используют mrna Nicrococcus varians

ЦМПВ В-2661, а очистку фермента проводят на фосфоцеллюлозе P 11 в

10 мМ калий-фосфатном буфере рН 6,57, 1 и элюцией градиентом хлористого калия 0,3-1,2 И.

2. Способ по п. 1, о т л и ч a— ю шийся тем, что штамм Nicrococcus varians ЦИПИ В-2661 выращивают на питательной среде, содержащей, г/л:

Пептон 9,0-10,0 . Дрожжевой экстракт 4,5-5,5

Хлористый натрий

1095645

Изобретение относится к микробиологической промыпленности, а именно, к производству ферментов.

Эидонуклеаза рестрикции Ича I может быть использована для исследования первичной структуры ДНК и в генной инженерии.

Известен способ получения эндонуклеазы рестрикции Есо R II узнающей и расщепляющей последователь- 10 ность нуклеогидов 5 СС(А/T)GG, пре1 дусматривающик культивирование штамма Escherichia coli В 834/ps в среде ,следующего состава, г/л:дрожжевой экст1ракт — 5,0 пептон — 10,0 NaCl - 15

0,5, МН+ С1 — 1,0, Na, НРО+- 7,0 <

KH РΠ— 3,0, разрушение клеток в прессе ДКИ-З, фракционирование полиэтиленимином, осаждение белков сернокислым аммонием, диализ, хроматог- 20 рафию на ДЭАЭ целлюлозе в 10 мМ калий-фосфатном буфере рН 7,0, содер.жащем 1 мМ ЭДТА, 7 мИ 2-меркаптоэтанол, 5Х глицерин, хроматографию на фосфоцеллюлозе, осеждение сернокис- 2g лым аммонием, гель-хроматографию на сефадексе С-100, рехроматографию на фосфоцеллюлозе и диализ 11). Эндонуклеаза рестрикции Есо R II узнает и расщепляет последовательность нуклео-З0 тидов 5 СС(А/T)GG, однако она не спо.собна расщеплять последовательность

5 СС (А/T)GG (где С" — метилцитозин), что является серьезным недостатком, так как рекомбинантные молекулы ДНК, 35 выделенные из штаммов Е.coli, содержащих метилазу dern, расщепляются не полностью рестриктазой Есо R II изза частичного метилирования цитозина в узнаваемои последовательности.

Другими недостатками известного способа является сложная и трудоемкая схема очистки и сравнительно низкий выход фермента (6,600 ед/г биомассы). 45

Способ получения эндонуклеазы рестрикции Tag XI узнающей пентануклеотид 5 СС(А/T)GG, предусматривает культивирование штамма Thermus aguaticus иа питательной среде, содержа- 50 щей 100 мп 1Х ТУЕ (10 r триптона и 10 г дрожжевого экстракта в 1 л воды)» 1 мп/л раствора микроэлемен тов Нитче (Nitsche) (0,5 мп Н,ЯО, 2,2 г ИпЗО, 0,5 г ZnS0, 0,5 г Н,Р0 55

0,016 г СИЗО, 0,025 г МаМоО, 0,046 г СаС1 -6Н О в 1 л воды) и по

50 мп/л растворов А и Б Кастенгольца соответственно А:2,0 г нитроуксусной кислоты, 20,0 мл 0,037. FeC1

1,2 r CaSO< 2Н,О, 2,1 г КМОз в 1 л оды и 8: 2,0 г NgS®7H О, 0 16 г °

NaCl 14,0 г МаМО,, 2,2 г Na,HP0> в

1 л воды) в 1 л воды, разрушение клеток ультразвуком, осаждение нуклеиноl вых кислот стрептомицинсульфатом, фракционирование белков сернокислым аммонием, хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе. в 20 мМ трис-НС1-буфере рН

7,5, содержащем 0,5 мМ ЭДТА, 7 ьИ

2-меркаптоэтанол, элюцию фермента с колонки ДЭАЭ-целлюлозы градиентом

NaC1 0-0,4 H диализ, хроматографию на гепарин-сефарозе в 20 мИ трис-НС1буфере рН 7,5, содержащем 0,5 мИ

ДТА, 7 мИ 2-меркаптоэтанол, элюцию фермента с колонки с гепарин-сефарозой градиентом NaC1 0-0,75 И, диализ.

Получили 5 000-6 000 ед/г биомассы, Эндонуклеаза рестрикции Tag XI расщепляет пентануклеотид 5 CC+(А/T)GG вне зависимости от наличия или отсутствия метнлированного цитоэина (помеченного звездочкой) Г2 .

Однако способ получения эндонуклеазы Tag Х1 имеет ряд недостатков: сравнительно невысокий выход фермента (5 000-6 000 ед/г биомассьф сложную н трудоемкую схему очистки рестриктазы и .многокомпонентную питательную среду культивирования штамма Thermus

aguaticus.

Цель изобретения — повьппение вы-: хода эндонуклеаэы рестрикции. .Цель достигается способом получения эндонуклеазы рестрикции, включающим выращивание микроорганизма— продуцента фермента, обладающего способностью узнавать и расщеплять последовательность нуклеотидов

1/

5 СС (А/T)GG, разрушение клеток ультразвуком, фракционирование белков и очистку фермента путем хроматографии, отличающимся тем, что в качестве микроорганизма - продуцента фермента используют штамм И сгоcoccus varians ЦИПМ В-2661, а очистку фермента проводят на фосфоцеллюлозе Р11 в 10 мМ калий-фосфатном буфере рН 6,5-7, 1 и элюцией градиентом хлористого калия 0,3-1,2 М.

Цель достигается способом, отличающимся тем, что штамм Micrococcus

varians ЦИПИ В-2661 выращивают на питательной среде, содержащей (г/л):

1095645

3 пептон 9,0-10,00. дрожжевой экстракт — 4,5-5,5, хлористый натрий—

4,5-5,0.

П р.и м е р, Используемый штамм

Micrococcus varians RFL 19 выделен из пищевода рогатого скота в Институте эпидемиологии, гигиены и микробиологии Литовской ССР. Штамм идентифицирован во ВНИИГПЭ и хранится в музее ВНИИгенетики под номером

ЦМПМ В-2661.

Полученный штамм М1сгососсиз varians RFL 19 обладает следующими морфологическими, культуральными и физиологическими признаками. Сфери- 15 ческие клетки величиной 1,0-1,5 мкм в диаметре. В стандартных жидких средах клетки расположены в виде неправильных пучков, в парах или по одной. На МПа после 24 ч инкубации 2g в термостате при 37 С образует круглые с ровными краями колонии 1,5, мм в диаметре. Колонии гладкие, с агаром не срастаются, желтоватого цвета. В мясо-пептонном бульоне обра- 25 зует мутность. Оптимальная температура роста 37 С. При 45 С обычно

L не растет. Грамположительные, каталазоположительные. Строгий аэроб.

Желатину гидролизирует. Глюкозу и ксилозу окисляет. Нитраты восстанавливают в нитриты. Резистентный к новобиоцину ) 2,0 мг/мл, Клетки не подвергаются лизису с лизоцимом при концентрации его 100 мг/мп. Культура хранится в пробирках на среде МПА под о вазелиновым маслом при +4 С.

Полученная эндонуклеаза Mva I характеризуется следующими свойствами: узнает и специфически расщепляет последовательность 5 СС(А/T)GG в молекуле ДНК; оптимальное значение рН для действия фермента 8,0-9,0; оптимальная температура действия

30-40 С; для активации эндонуклеазы требуются ионы Hg+, их оптимальная концентрация 10-15 мМ.

Получение эндонуклеазы Mva I из

Micrococcus varians PFL 19

Последовательность операций.

Получение биомассы поддерживание посевного материала; 55 выращивание посевного материала; культивирование штамма.

Выделение и очистка рестриктазы разрушение клеток; хроматография на фосфо-i целлюлозе.

Для получения биомассы используют следующую аппаратуру: круговые термостатированные качалки, фотоэлектрокалориметр ФЭК-56М, лабораторный ферментер типа "Биолафит" и проточную центрифугу С-44.

Для поддерживания и культивирования штамма используют две среды: мясо-пептонный бульон (МПБ и МПА) и питательную среду, содержащую, г/л: пептон — 10,0; дрожжевой экстракт—

5,0 и NaC1 — 5,0, рН 7,0. Мясо-пептонный агар для поддержания и оживления штамма готовят по известным методам ("Практикум по микробиологии", 1976) из мясо-пептонного бульона с последующим добавлением агара до

27-ной концентрации рН 7,3-7,4. МПБ и, МПА стерилизуют при 0,8 атм 30 мин.

МПБ оазливают в пробирки по 5 мл, а

МПА — в чашки Петри. Питательную среду для культивирования стерилизуют при 1 атм 20 мин.

Штамм Micrococcus varians RFL 19 поддерживают в пробирках на среде

МПА под вазелиновым маслом при +4 С.

Для оживления Microcossus varians пересевают на MIIA и инкубируют коло нии при 37 С в течение 18-20 ч. Зао тем бактериологической петлей пересевают в пробирку с 5 мп МПБ и инкубируют в термостатированной качалке с 250 об/мин при 37 С в течении 67 ч.. Для засева ферментер на 10 л культуральной среды готовят 0>5 л инокулята (2 качалочные колбы по 250 мл). В каждую колбу засевают по О, 1 мл 6-7 ч суспензии клеток.

Выращивание инокулята проводят на круговой термостатированной качалке (250 об/мин) при 37 С 18—

20 ч. Оптическая плотность инокулята после выращивания составляет о,5см

А = 2,6-2,8 о.в. Полученный ино-. кулят (0,5 л) засевают в ферментер с 9,5 л культуральной среды при рН среды 7,0 и 37 С. Выращивание о проводят с постоянной подачей воздуха в первые 2 ч выращивания 4 л/мин, последующие — 9-12 л/мин и постоянным перемешиванием в первые 2 ч 300-400 об/мин, последующие—

500 об/мин.

Спустя 7-8 ч выращивание прекращают. Оптическая плотность культу1095645

10

20 ктазы Mva I, 30

4Q

55 ральной жидкости составляет А =

540 2,6-3,0, о. в., что соответствует концу логарифмической фазы роста культуры.

Культуральную жидкость охлаждают по +4 С и центрифугируют на проточ- . о ной центрифуге С-44 при 25 000 об/мин.

Выход сырой биомассы: 2,3-3, 1 г/л культуральной жидкости.

Для выделения и очистки рестриктазы используют следующую аппаратуру: ультразвуковой деэинтегратор типа MsH, центрифугу Бекман Ж 21Ц, холодильную камеру "Колора", хроматографическую колонку, термостат, аппарат для дискового электрофореза и унйверсальный источник питания

УИП-1.

ДНК фага h выделена по методике:

Saito Н., Miura К.J. (Biochem. Biophys ° Acta. 1963, 72., 619-629) .

При разрушении клеток используют буфер А (10 ьф калий-фосфатный буфер рН 7,0, 10 мМ ЗДТА, 7 мМ 2-меркаптоэтанол, 0,15. М NaC1, 1 мг/мл лизоцим), для хроматографии на фосфоцеллюлозе используют буфер Б (10 мИ калий-фосфатный буфер рН

7,0, 1 мМ ЭДТА, 7 мИ 2-меркаптоэтанол).

Активность фермента определяют методом гидролиза ДНК фага h с последующим разделением полученных фрагментов электрофорезом в стеклянных трубках с агарозными гелями. Реакционная смесь для гидролиза содержит 75 мИ трис-НС1 рН 8,5, 60 мМ йаС1, 15 мИ MgC1, 70 мкг/мл альбумин, 2 мкг, ДНК в 40 мкл смеси и от 1 до 5 мкл фермента. Реакцию проводят при 37 С 1 ч. Электрофорез выпроводят в О, 1 М натрий-боратном буФере, рН 8,2, 2 мМ трнлона Б, в течение 1 ч при напряжении 70 В и силе тока 4 мА на трубку. Окрашенные этидий бромидом (1 мкг/мп) гели просматривают в УФ-свете.

3а условную, единицу активности принимается то количество фермента,. которое в оптимальных условиях за

1 ч полностью расщепляет 1 мкг ДНК фага. Ь .

Все операции по выделению и очист

D ке фермента проводят при +4 С.

3 г биомассы, полученной при культивировании Microcbccus varians

RFL 19, суспендируют в 12 мл буфера

А, выдерживают 18 ч при +4 С, обрабатывают ультразвуком на дезинтеграторе мощностью 100 W в течение 6 мин и центрифугируют при 20 000 об/мин в течение 1 ч. В полученный бесклеточный экстракт добавляют сухой КС1 до конечной концентрации 0,3 М и со скоростью 10 мл/ч наносят на колонку (1 х 10 си), с фосфоцеллюлозой P 11, уравновешенной буфером Б, содержащим 0,3 М КС1. Колонку промывают этим же буфером и фермент элюируют градиентом КС1 (0,3-1,2) в буфере

Б. Фракции с наибольшей эндонуклеазной активностью, элюируемые при 0,951,05 М КС1, объединяют н диалиэируют против буфера Б, содержащего 0,2 М

КС1 и 50Х глицерин. Ферментный препарат хранят при -20 С. Из 1 г био массы получают 200.000 единиц рестриОпределение последовательности нуклеотидов, узнаваемой эндонуклеазой рестрикции Mva I.

В опытах по определению последовательности нуклеотидов, узнаваемой эндонуклеазой Mva I были использованы ДНК ф XI74, d u pBR 322, выращенные на .штамме Е.cali НВ 101, содержащем метилазу dern.

Проведено расщепление этих ДНК эндонуклеазой Ича 1 эндонуклеаэой

Tag XI и совместное расщепление этими ферментами. Во всех случаях электрофореграммы совпадают с электрофореграммой, полученной после обработки только эндонуклеазой Tag XI, что указывает на то, что эти рестриктазы являются изошизомерами, т.е. расщепляет последовательность нуклеотидов 5 СС (А/T)GG независимо от наличия или отсутствия метилированного цитозиыа, помеченного звездочкой. а

Предложенный способ получения эндонуклеазы рестрикции позволяет получить высокоочищенный ферментный препарат, повысить выход фермента с 5 000-6 000 ед/г до 200 000 ед/г.