Способ идентификации галофильных вибрионов
СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ ГАЛОАИЛЬНЫХ ВИБРИОНОВ путем выращивания исследуемого материала на хштательной среде, отличающийся тем, что,с целью ускорения и упрощения способа, вьфащивание осуществляют в присутствии фага Vibrio alginolyticus 531,Vibrio alginolyticus 337 и/или Vibrio alginolyticus 532.
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР
llO ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 3497283/29-13, 3496554/28-13, 3496551/28-13 (22) I9.07.82 (23) 14.10.82 (46) 15.11.84. Бюл. У 42 (72) Г.М. Голковский, А.Е. Либинзон и В.К. Кирдеев (53) 576.8.077.5 (088.8) (56) 1. Микробиологическая и лабораторная диагностика холеры (краткое руководство). Ростовское книжное изд-во, 1975, с. 43.
„.Я0„, 1124030 А (54)(57) СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ ГАЛОФИЛЬНЫХ ВИБРИОНОВ путем выращивания исследуемого материала на .питательной среде, отличающийся тем, что,с целью ускорения и упрощения способа, выращивание осуществляют в присутствии бага Vibrio aIginoIyticns 531, Vibrio aIginoIyticus
337 и/или Vibrio aIginoIyticns 532. с 1 1 1240
Изобретение относится к микробно=, логии, в частности к лабораторной диагностике галофильных вибрионов. . Известен способ идентификации галофильных вибрионов путем выращи5 вания исследуемого материала на питательной среде с последующим пересевом и идентификацией по биохимическим тестам 1.13.
Однако известный способ длителен и сложен в. осуществлении, так как многоэтажен, требует набора индика- торных питательных сред.
Цель изобретения — ускорение и упрощение способа.
Цель достигается тем, что согласно способу идентификации галофильных вибрионов путем выращивания исследуемого материала на питательной среде,. выращивание осуществляют в присутствии фага Vibrio alginolyticus 531, Vibriо а1 inolyticus 337 и/или
Vibrio alginolyticus 532.
Фаг Vibrio alginolyticus 531 выделен при исследовании мидий, выловленных в Севастопольской бухте. Фаг
Vibrio alginolyticus 531 хранится в коллекции бактериофагов Тбилисского
НИИВС МЗ СССР под номером Ф-107 и характеризуется следующими признака30
Морфологические и культуральные свойства.
Головка вибрионов фага Vibrio
aXginoIyticus имеет в проекции гексагональную форму размером . З5
806 А 118 A - 740 419 Х. Длина ото ростка 1271 +31 А,его диаметр
277 + 18 А. Доверительные интервалы средних величин определены для уровня достоверно .ти, равного 99Х
{р = 0 01).
Фаг 531 с сокращающимся чехлом отростка, относится к 5-й морфологической группе по классификации
А.С. Тихоненко. 45
Фаг 531 активно репродуцируется на клетках индикаторного штамма
Vibrio aIginoIyticus 434 в щелочном бульоне и бульоне Мартена с ЗХ
NaCI при 37 С. При посевной дозе 50 фага 2 .10 мл и множественности инфекции — 10 в течение 6 ч в 1 мл среды накапливается 6 -10 вибрионов.
Негативные колонии фага 531 воспроизводятся с помощью двуслойного 55 метода Грациа, в качестве нижнего плотного слоя. используют щелочной
2Х-ный агар Мартена с ЗХ NaCI или
30 2 другие щелочные среды для выделения вибрионов (изготовленные в Иркутском ПЧИ Сибири и Дальнего Востока или в Московском институте вакцин и сывороток им. Мечникова) с повышенной концентрацией соли. На пластинки плотного агара выливают вторым слоем смесь расплавленного и охлажденного до 45 С 0,7Х-ного агара Мартена с 2X NaCI 2-3 часовой .бульонной культуры индикаторного штамма и 50-100 вибрионов фага в
О, 1 мл среды. Через 16-18 ч при
20-25 С фибрионы фага 531 образуют в мягком слое агара с индикаторной культурой Vibrio aIginoIyticus 4892 мутные колонии округлой формы диаметром 3-4 мм.
При нанесении капли фага 531 на газон индикаторного штамма непосредственно на плотном arape или в слое мягкого агара наблюдается неполный лиэис.
Фаг 531 полностью нейтрализуется гомологичной сывороткой и не нейтрализуется сыворотками к гетерологичным фагам галофильных и других вибрионов.
Фаг Vibrio aIginoIyticus 531 в концентрации 8 10з лизирует 15Х испытанных культур галофильных вибрионов, нелизирующихся фагамн 337 и
532. Фаг обладает высокой специфичностью в отношении галофильных вибрионов и не лиэирует вибрионы вида
Vibrio choIerae 01 и не 01 группы, а также микроорганизмы других родов и семейств: Aегоmonas, Anaегоgenes, Escherichia coIi, Pseudomonas.
Aeruginosa. На этом основании фаг может быть использован для индентификации галофильных вибрионов как в составе поливалентного препарата, так и для фаготипирования в качестве монофага.
Штамм фага Vibrio aIginoIyticus
337 вьделен при исследовании краба, выновленного в Севастопольской бухте.
Штамм фага Vibrio aIginoIyticus
337 хранится в коллекции бактериофагов Тбилисского НИИВС МЗ СССР под номером Ф-105 и характеризуется следующими признаками.
Морфологические и культуральные свойства.
Головка вибриона фага 337 в проекции имеет гексагональную форму, размерами 574 + 45 530 + 42 а. Дли124030 Ю
1О
Ю
1Р
40
50
55 з 1 на отростка 103 и 22 А. Доверительные интервалы средних величин определены для уровня достоверности, равного 99%. (р = 0;01). Фаг 337. с. коротким отростком и относится к
3-й морфологической группе по классификации А.С. Тихоненко.
Фаг 337 активно репродуцируется в щелочном бульоне Мартена (рН 7,67,8) с ЗХ NaCI на клетках индикаторного штамма Vibrio aIginoIyticus
N 262. При посевной дозе фага 5 -10S и множественности инфекции 5 через 3,5 ч нри 35-37 С в 1 мл среды накапливается 2 ° 10 вибрионов. НегаЭ тивные колонии фага 337 воспроизводятся с помощью двуслойного метода Грациа. В качестве нижнего плотного слоя используют щелочной
2Х-ный агар Мартена с 3% NaCI или. другие щелочные среды для выделения вибрионов (изготовленные в
Иркутском ПЧИ Сибири и Дальнего
Востока или в Московском институте вакцин и сывороток им. Мечникова).
На пластинки плотного агара выпивают вторым слоем смесь расплавленного и охлажденного до 45 С
0,7%-ного Мартена с 2% NaCI, с
0 2 мл 2-3 часовой бУльонной кУльтуры индикаторного штамма и 50100 вибрионов фага в О,! мп бульона.
Через 16-18 ч при 20-25 С вибрионы фага 337 образуют в мягком слое агара с индикаторной культурой
Vibrio aIginoIyticus 262 негативные колонии округлой формы с прозрачным центром и узким мутным ободком по периферии.
При нанесении капли фага 337 на газон:индикаторного штамма непосредственно на плотном агаре или в слое мягкого агара происходит полный лизис культуры.
Фаг Vibrio aIginoIyticus 337 полностью нейтрализуется гомологичной сывороткой и не нейтрализуется сыворотками к гетерологичным фагам галофильных и других вибрионов, обладает узким диапазоном и лизйрует ЗХ культур галофильных . вибрионов, не лизирующихся другими фагами. Фаг специфичен и не лизирует представителей вида Vibrio
choIerae 0,1 и не 01 группы, а также микроорганизмы других родов и семейств: Aегоmonas anaегоgenes, Escherichia coIi, Pseudomonas
aeruginosa. На этом основании фаг может быть использован для идентификации галофильных вибрионов как в составе поливалентного препарата, так и для фаготипирования в качестве монофага.
Штамм фага Vibrio aIginoIyticus
532 выделен при исследовании мидий, выловленных в Севастопольской бухте.
Фаг Vibrio aIginoIyticus 532 хранится в коллекции бактериофагов
Тбилисского НИИВС МЗ СССР под номе" ром Ф-105 и характеризуется следующими признаками.
Морфологические и культуральные свойства.
Головка вибрионов фага 532 имеет в проекции гексагональную форму, размером 1138 2 65 А 1062 4 64 3.
Длина отростка 2599 - 162 1, ширина 270 + 11 А. Доверительные интервалы средних величин определены для уровня достоверности, равного
99% (р = 0,01). Фаг 532 с сокращающимся чехлом отростка относится к 5-й морфологической группе по
Т.И. Тихоненко.
Фаг 532 активно ренродуцируется на клетках индикаторного штамма
Vibrio aIginoIyticus 532 с щелочном бульоне Мартена с 2-3% NaCI при 35-37 С. При посевной дозе фага ° 10 мл среды и множественнос5 ти инфекции 1/15 в течение 3,5 ч в 1 мл среды накапливается 1,5 -l0 вибрионов фага.
Негативные колонии фага 532 воспроизводятся с помощью двуслойного метода Грациа. В качестве .нижнего плотного слоя используют щелочной 2%.-ный агар Мартена с 3%
NaCI или другие плотные щелочные среды для вщделения вибрионов (из готовленные в Иркутском ПЧИ Сибири и Дальнего Востока илн в Московском институте вакцин и сывороток им. Мечникова) с повышенной концентрацией соли. На пластинки плотного arapa выпивают вторым слоем смесь расплавленного и охлажденного до 45 С 0,7Х-ного агара Мартена с 2% NaCI, 0,2 мл 2-3-часовой бульонной культуры индикаторного штамма и 50-100 вибрионов фага в О, 1 мл среды. Через
16-18 ч при 20-25 С вибрионы фага 532 образуют в мягком слое агара с индикаторной культурой Ч Ъг1о
aIginoIyticus 532 колонии округлой
Составитель Г. Смирнова
Техред С.Мигунова Корректор В- Гирняк
Редактор М. Дылын
Тираж 521 Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий
113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д, 4 5
Заказ 8208/24
Филиал ППП "Патент ", r. Ужгород, ул. Проектная„4
3 1 1 формы с прозрачным центром и мутной периферией, диаметром 2-3 мм.
При нанесении капли фага 532 на газон индикаторного штамма непосредственно на плотной среде или в мягком слое агара наблюдается лнзис культуры.
Фаг Vibri.o aIginoIyticus 532 полностЬю нейтрализуется гомологичной сывороткой и не нейтрализуется сыворотками к гетерологичным фагам галофильных и других вибрионов.
Фаг Vibrio aIginoIyticus 532 ли- зирует 40% испытанных культур
Vibrio aIginoIyticus и обладает высокой специфичностью в отношении гальфильных вибрионов. Он не лизирует вибрионы вида Vibrio choIerae . 01 и не 01 группы, а,также микроорганизмы других родов и семейств: .
Aегоmonasanaегоgenes, Escherichia
coIi, Pseudomonas aeruginosa. В связи с этим он может. быть использован для идентификации галофильных вибрионов как в составе поливалентного препарата, так и для фаготипирова.ния в качестве монофага.
Пример 1. Использование фага Vibrio aIginoIyticus 531 для идентификации культур галофильных вибрионов."
Из испражнений больного острой кишечной инфекцией, подозритель-ной по клиническому течению.на забо левание, вызванное галофильными вибрионами, была выделена культура грамотрицательных бактерий. Идентификацию этой культуры с помощью
clara Vibrio aIginoIyticus 531 проводят следующим образом.
Культуру засевают в бульон Мартена с 3% NaCI и помещают в термостат на 3 ч. 0,2 мл выросшей культуры смешивают с 5 мл расплавленного
24030 6 и охлажденного до 45 С 0,7%-ного агара Мартена с 2% NaCI и наливают вторым слоем на пластинки 2%-ного araра Мартена с 3% NaCI в чашках Петри.
5 После подсушивания на поверхность мягкого агара с культурой наносят ,стерильной пипеткой каплю фага
Vibrio aIginoIyticus 531. Посевы оставляют при комнатной температуре.
Через 18 ч на месте нанесения капли фага наблюдают просветление газона культуры, свидетельствующее о ее растворении. Лизис изучаемой культуры под действием фага Vibrio aIginoIyticus 531 позволяет идентифицировать ее как галофильный вибрион.
Пример 2. Вццеленная к,льтура не лизировалась фагом Vibrio
aIginoIyticus 531. По методике, 20 описанной в примере 1, была определена ее чувствительность к фагу 337.
Лизис изучаемой культуры под действием фага Vibrio aXginoIyticus 337 свидетельствует о ее принадлежности к галофильным вибрионам.
Пример 3. Выделенная культура не лизируется ни одним из фагов Vibrio aXginoIyticus (531 и
337). По методике, описанной в при3(.: мере 1, быпа определена ее чувстви-тельность к фагу Vibrio aIginoIyticus 532. Лизис изучаемой культуры под действием фага Vibrio aIginoIyticus 532 свидетельствует о ее принадлежности к галофильным вибрионамe
Аналогичным образом были идентифицированы культуры, выделенные из морской воды и гидробионтов, а также определена чувствительность музейных культур к фагам 531, 337,532.
Использование предложенного спо- ., соба позволит s короткие сроки проводить ндентификацию галофнльных вибрионов менее трудоемким способом.
