Способ определения связывающей способности рецепторных белков со стероидными гормонами
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СВЯЗЫВАЮЩЕЙ СПОСОБНОСТИ РЕЦЕПТОРНЫХ БЕЛКОВ СО СТЕРОИДНЫМИ ГОРМОНАМИ путем добавления к биологической пробе радиоактивного стероидного гормона, определения радиоактивности в пробе без и с добавлением нерадиоактивного стероидного гормона с последующим осаждением редепторов стероидных гормонов протаминсульфатом, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа, дополнительно определяют белок в осадке после добавления протаминсульфата к биологической жидкости в конечной концентрации 0,08-0,125%, а связующую способность N (моль/мг) определяют по формуле N Ai-A- С где А - радиоактивность стероидного гормона в пробе без добавления нерадиоактивных стероидных гормонов; А, радиоактивность стероидных i гормонов в пробе с добавлением нерадиоактивных стеро (Л идных гормонов; количество белка в осадке i С после добавления протаминсульфата; В удельная радиоактивность стероидного гормона. iNd 4 Ю 1C VI
СОЮЗ СОВЕТСНИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ
РЕСПУБЛИК,С 01 М 33/48 зов
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР пО делАМ изОБРетений: и ОтнРытий
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 3514406/28-13 (22) 22. 11. 82 (46) 15. 11.84. Бюл. Р 42 . (72). В.Г. Дегтярь, Н.Е. Кушлинский и Ю.В. Милосердов (71) Всесоюзный онкологический научный центр АМН СССР (53) 612.398(088.8) (56) 1.Steggles А.W., King R,I.В.
The use of Protainine to study
67-ЗН-Oesteadiol-178 Binding in Rat
Uterus. — "Biochim 3", 1970, 118, р. . 695-701. (54)(57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СВЯЗЫВАЮЩЕЙ СПОСОБНОСТИ РЕЦЕПТОРНЫХ БЕЛКОВ
СО СТЕРОИДНЬКИ ГОРИОНИЯ путем добавления к биологической пробе радиоактивного стероидного гормона, определения радиоактивности в пробе без и с добавлением нерадиоактивного стероидного гормона с последующим осаждением рецепторов стероидных гормонов протаминсульфатом, о т л и„,Я0.„1124227 А ч а ю шийся тем, что, с целью повышения точности способа, дополнительно определяют белок в осадке после добавления протаминсульфата к биологической жидкости в конечной концентрации 0,08 -0,125Х, а связуницую способность N (моль/мг) определяют по формуле
N А -А
С В где А — радиоактивность стероидного
1 гормона в пробе без добавления нерадиоактивных стероидных гормонов;
A - радиоактивность стероидных гормонов в пробе с добавлее нием нерадиоактивных стероидных гормонов;
С вЂ” количество белка в осадке 1 после добавления протаминсульфата;
 — удельная радиоактивность стероидного гормона. )иии
I 1124227
Изобретение относится к биохимии r стероидных гормонов и может быть использовано для количественного определения связывающей способности рецепторов стероидных гормонов в разных тканях, преимущественно в тканях органов-мишеней.
Способ количественного определения белка имеет важное значение при исследовании рецепторов стероидных гормонов, так как используется для вычисления связывающей способности этих рецепторов к стероидам в большинстве методов их определения в тканях. 15 !
A A
Известен способ определения свя.зывающей способности рецепторных белков со стероидньпли ормонами.)1), Однако. белки — рецепторы составляют лишь незначительную часть суммарных белков цитозольной фракции и известный способ не позволяет. провести количественное определение рецепторных белков стероидных гормонов, поэтоьлу вычисление связывающей способности с использованием суммарного белка не точно отражает связывающую способность рецепторов стероидных гормонов. Кроме того, при определении белка по известному способу невозможно учесть. вклад, . который вносят белки крови, присутствующие в тканях животных и особенно человека (эбиопсийный материал, удаление тканей при операциях) в
35 значительных количествах.
Цель изобретения — повышение точности способа.
Поставленная цель достигается
4О тем, что согласно способу определения связывающей способности рецепторных белков со стероидными гормонами путем добавления к биологической пробе радиоактивного стероидного
45 гормона, определения радиоактивности в пробе без и с добавлением нерадиоактивного стероидного гормона с последующим осаждением рецепторов стероидных гормонов протаминсульфатом дополнительно определяют белок
59 к осадке после добавления протаминсульфата к биологической жидкости в конечной концентрации 0,08-0,125, а связывающую способность N (моль/мг) опрецеляют по формуле
2 де А — радиоактивность стероидного л гормона в ."робе без добавления нерадиоактивных стероидных гормонов;
А, — радиоактивность стероидного гормона в пробе с добавлением нерадиоактивньм стероидньм гормонов;
С вЂ” количество белка в осадке после добавления протаминсульфата;
 — удельная радиоактивность стероидного гормона.
Способ осуществляют следующим образом.
К части цитозольной фракции добавляют раствор протаминсульфат:" в буфере, чтобы получнть конечную концентрацию протаминсульфата в растворе 0,08-0,i25 . Образующийся осадок центрифугируют и промывают дополнительно исходным раствором протаминсульфата, а затем растворяют в минимальном объеме ледяной уксусной кислоты.К раствору рецепторньм белков в ледяной уксусной кислоте добавляют водный концентрированпый раствор едкого натра для нейтрализации уксусной кислоты до
pEI 8,0-8,5". Объемы уксусной кислоты и концентрацию раствора едкого натра выбирают с таким расчетом, чтобы конечный объем, используемый для определения белка, соответствовал методике определения белка.
Количественное определение белка предлагаемым способом проверено на цитозольных фракциях тканей рака . молочной железы, рака и аденомы предстательной железы, матки и вентральной простаты крыс линии Вистар весом
120-130 г.
Пример 1.Ткань (рак.молочной железы человека) измельчали в ступке при охлаждении жидким азотом, ! смешивали с буфером (состав буфера:
10 моль/л трис-НСь; 1,5 моль/л ЭДТА, 1 моль/л дитиотрейтола и 0,3% азида натрия, рН 7,4 при 20 С,10 об.% глицерин в соотношении (4-10)."1 (объем буфера в миллилитрах, вес ткани в граммах). Центрифугируют после размораживания 10 мин при 2500-3000 g, затем надосадочную жидкость центрифугируют при 105000 д 60 мин. К
100 мл полученного цитозола добавляют равный обьем О» 16-0,25 -ного раствора протаминсульфата в буфере.
Составитель E. Житникова
Редактор Л.Пчелинская Техред)К.Кастелевич Корректор И. Эрдейи
Заказ 8272/34 Тираж 822 Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий
113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5
Филиал ППП "Патент", r. Ужгород; ул. Проектная, 4
Э I
Смесь инкубируют 10 мин, затем центрифугируют 10 мин при 2500-3000 g, при этом белки — рецепторы стерондных гормонов отделяют в виде осадка.
Недостаточную жидкость;отбрасывают, а осадок промывают не менее 2-х и не более 4=х раз 1,0 мп охлажденного
0,08-1,25 -ного раствора протаминсульфата в буфере без днтиотрейтола.
Промытый осадок растворяют в нормальньм условиях в 40-60 мл ледяной кислоты, добавляют эквивалентное, количество 40-60Х-ного раствора едкого натра и количественно определяют белок по методу Лоури. Кон-. центрация белка для указанной ткани составляет 3-67 °
Величина связывающей способности белка исследуемой ткани молочной железы КО (Нз) 5oL-дигидротестостероид равна 16 фемтомоль/мг.
Пример 2. К пробам цитозола, полученного из ткани аденомы предстательной железы человека анало-гично примеру 1, добавляли равный
124227 объем раствора протаминсульфата с разной концентрацией, осадок в пробах обрабатывали и количественно определяли белок аналогично примеру
1. Связывающая, способность белка к, (Н 3 5 -дигидротестостерону исследуемой ткани составила 12 фемтомоль/мг белка.
Использование предлагаемого cnocojp ба определения рецепторных белков стероидных гормонов в цитозольной фракции тканей животных и человека после осаждения протаминсульфатом позволяет точно количественно определять рецепторные белки стероидных гормонов цитозольной фракции тканей животных и человека в результате исключения влияния белков и белков цитозольной фракции тканей, не осаж2р даемых протаминсульфатом, на количественное определение белка, что обеспечивает более точное вычисление связывающей способности цитозольных рецепторов стероидных гормонов
25 по отношению к стероидам.
