Способ получения производных @ -карбамилфенилглицина

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОИЗВОДНЫХ Ы-КАРБАМШ1ФЕНШ1ГЛИ1ЩНА путем ферментативного гидролиза растворов соответствуюпщх производных гидантионов , отличающийся тем, что, с целью обеспечения возможности использования концентрированных растворов 1гидантоинов при высоком выходе целевых продуктов, ферментативный гидролиз осуществляют штаммом Bacillus brevis NRRL 1286 или Bacillus stearothermophilus NRRL 1287 при 40-50 0. О)

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦ ВЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК д511 С 12 Р 13/00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР.

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

H IlATEHTY

У(-)В-кй1Иа аи1фенм иихф а/, р (21) 2589348/28-13 (22) 15.03. 78 (31) 21232 А/77 (32) 15.03.77 (33) Италия (46) 15. 11.84 Бюп. 11 42 (72) Аурелио Вилья, Эудженио Фасчетти, Елена Перрнконе (Италия) и Людвиг Деген (ФРГ) (71) Аник С.п.А. (Италия) (53) 663.18(088.8) (56) 1. Патент СССР В 810082, кл, С 12 Р 13/04, опублик. 1981.

„,SU „„1124889 А (54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОИЗВОД Ъ|Х N-КАРБАИИЛФГНИЛГЛИЦИНА путем ферментативного гидролиза растворов со" ответствующих производных гидантионов, отличающийся тем, что, с целью обеспечения возможности

> использования концентрированных растворов гидантоинов при высоком выходе целевых продуктов, ферментативный гидролиз осуществляют штаммом Bacil

lus brevis NRRL 1286 или Bacillus

stearothermophilus NRRL 1287 при

40-50 С.

89 3

1 . 11248

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к способу получения производных фенилглицина, в частности N-карбамилфенилглицина и карбамилпараметокси5 фенилглицина, используемых в фарма— цевтической промышленности.

Известен способ получения производных фенилглицина, в том числе

N-карбамилфенилглицина, заключающийся в проведении ферментативного гидролиза 5-(D,L) -фенилгидантоина штаммом Pseudomonas sp. 942 или 945 при

30 С в течение 24 ч 1).

Выход целевого продукта составляет 57-907 от теоретического при максимальной концентрации 20 мм/мп.

Цель изобретения — обеспечение возможности использования концентрированных растворов гидантоинов при высоком выходе целевых продуктов.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения производнык N-карбамилфенилглицина, предусматривающему ферментативный гидролиз растворов соответствующий производных гидантоинов, Ферментативный гидролиз осуществляют штаммом

Bacillus brevis NRRL 1286 или Bacil—

lus ьtearothermophilus NRRL 1287 при 40-50 С.

Способ осуществляется следующим образом.

Бактериапьные штаммы, выделенные из почвы, овощей и мусора, инокулируют при 50 С со скошенного агара в 35 колбы Эрленмейера объемом 250 мл, содержащие каждая по 50 мл следующей питательной среды, при рН 7,2, г/л:

Мясной пептон !О

Дрожжевой экстракт 10

NaC1, 3

5-D L-метилгидантион l

Э о

Среду стерилизуют при 110 С в течение 30 мин. Инкубирование проводят ч течение 18-20 ч при 50 С при перео 45 ешивании. В колбу Эрленмейера объем

500 мл помещают 100 мл той же среды с добавлением 2 мл предварительно

- приготовленной культуры. После 1618 ч дополнительной выдержки проводят ферментативную реакцию, для чего в пробирку, содержащую 10 мп 0,07 M фосфатного буфера при рН 8,5 и

20 мкмоль/мп 5-D L-фенилгидантоина, вносят f мл бактериальной суспензии (сухой вес 40 мг/мп). По прошествии

15 мин инкубирования при 40 С прово. дят реакпию с b -диметиламинобензальдегидом для количественного определения полученного таким путем карбамилпроизводного.

В способе используют культуры

Bacillus brevis u Bacillus stefrothermophilus которые были переданы на хранение в 1977 r. в Северный региональный исследовательский центр

r. Пеория, штат Иллинойс, США. Им были присвоены номера NRRL 11079 для штамма 1286 и NRRL-В 11080 для штамма 1287.

Характеристика штаммов представлена в табл. I.

Во время протекания ферментативного гидролиза D -гидантоина при рН 7-10 установлено, что в результате получающиеся карбаминпроизводные находятся в D-форме. Химическая структура и его .идснтичность N -карбамил-! фенилглицину и N-карбамилпараметоксифенилглицину подтверждена после перектристаллизации продукта реакции с помощью ИК-спектров N.M.R. массспектрометрии и элементарного анализа. Постоянные оптического вращения

25оС о составляют соответственно (oL) +-137 (С=1 в 1 н. растворе ЯН+ОН) ego(3

zoo

140 (С=1 в 1 н. растворе МН4ОН), что соответствует литературным данным.

Гидролиз может протекать при использовании целых клеток микроорганизмов, спор .или экстрактов вышеназванных микроорганизмов с помощью так называемых покоящихся клеток, для чего выделенные из культуральной среды бактериальные клетки после тщательной промывки суспендируют в буфере с добавлением рацемического гидантоина. Могут быть использованы препараты, содержащие гидролазу, такие как ее экстракты или концентраты, очищенные гицролазы, полученные с использованием вышеназванных микроорганизмов.

Пример 1..Готовят среду для бактериального штамма В.brevis 1286 следующего состава, г/л:

Мясной пептон 10

Дрожжевой экстракт 10

NaCi 3

5-D,L-метилгидантоин 1

PH среды доводят до 7,2, стерилизуют при 110 С в течение 30 мин и инкубируют. Отбирают 100 мл культуральной жидкости, помещают в колбу

Эрленмейера объемом 500 мл и добавляют на 18 часу инкубирования (с ис1 1248

3 пользованием планетарной мешалки) при 40 С 100 мл 0,14 И фосфатного буфера (рН 8,5) содержащего

40 мкмоль/мп 5-(Р,L) -фенилгидантоина.

По прошествии еще 4 ч инкубирования

5 при тех же условиях определяют количество полученного таким путем Nкарбамилф енилглицина .

Из 705 мг 5-(D,Е)-фенилгидантаина получают 700 мг И-карбам лфенилглицина, что соответствует выходу приблизительно 90%.

Пример 2. Также, как в примере 1, но по прошествии 4 ч при

40 С и с помощью штамма В. stearo15

thermophilus NRRL 1287 из 705 мг

5-(D,L)-фенилгидантиона получают

600 мг N-карбамилфенилглицина, что соответствует выходу около 85%.

Пример 3. Готовят среду, имеющую приведенный выше состав и содержащую 1 г/л 5-(D,L)-метилгидантоина. Добавлением соды рН доводят до 7,5 и культуральную жидкость распределяют порциями по 50 мл в

Эрленмейера объемом 250 мл. После стерилизации в течение 30 мин при

110 С колбы инокулируют штаммом Вас Пса brevis NRRL 1286 со скошенного агара, содержащего ту же твердую среду с агаром (фирма "ЦИФКО") при

2%-ной концентрации, и инкубируют в течение 22 ч при 40-С с использовао, нием планетарной мешалки со скоростью 220 об./мин.

Используя полученную культуру (оптическая плотность 0,4 при 550 нм, разбавление 1:10) в количестве 2 мп для инокулирования 100 мл той же сре †ды в 500-миллилитровых колбах Эрлен— мейера, полученную культуру инкуби- 40 руют при 40 С с использованием планетарной мешалки (220 об./мин), в течение 18 ч. Клетки отделяют от бульона центрифугированием при

g-500 (g — ускорение силы тяжести) 45 в течение 20 мин, промывают трижды изотоническим раствором при рН 8,0 и суспендируют в 0,07 M фосфатном буфере (рН 8,5), получая тем самым покоящиеся клетки. 50

Для проведения реакции ферментативного гидролиза при 40 С и перемешивании (220 об/мин) в 250-миллилитровых колбах Эрленмейера инкубируют

64 мп реакционной смеси, содержащей

200.мг бактерий (сухой вес) и

20 мкмоль/мп 5-(D,L)-фенилгидантоина (3,52 мг/мп). В подходящие моменты времени проводят измерения содержания продукта гидролиза т,e. D-карбамилфенилглицина, с использованием колорнметрического метода на

438 ммкм.

Еа чертеже дана кривая зависимости, выражающая процент теоретического выхода получаемого карбамилпроизводного.

Пример 4. Бактериальные клет ки штамма В. brevis NRBL 1286 получают описанным в примере 3 путем.

Суспензию клеток (41,5 мг/мп сухих бактериальных клеток) помещают в буфер фосфатных солей при рН 8,5, подвергают механическому измельчению в гомогенизаторе типа Manton laulin при температуре ниже 35 С и давлении

650 кгс/см Клеточный мусор отделяют от экстракта в с помощью центрифугирования (25000-кратное ускорение силы тяжести в течение 30 мин). К 970 мл

0,2 М буфера фосфатных солей (рн 8,5), содержащего 4,7 г 5-(D,L) -фенилгпдантоина, добавляют 30 мл экстракта, содержащего 280 ед. фермента (одна единица соответствует количеству фер-. мента, которое обеспечивает преобразование 1 мкмоль/мл в минуту субстрата в 0,2 И фосфатном буфере, рН 8,5, при 50 С, причем буфер содержит 20 мкмоль/мл 5-(D,L)-фенилгидантоина). По прошествии одного часа образуется 3,2 г И вЂ карбамилфенилглицина, что соответствует приблизительно 63% полногб гидролиза.

Пример 5. Готовят полусинте" тическую среду, имующую следующий состав, г/л: ин„сХ 5

Наг РО 7,05

КнгРО 2,72

Мясной пептон 5

Дражжевой экстракт 0,5

5- (D,L) -Цетилгидантоин 1,0

Среду распределяют порциями по

50 мл в колбы Эрленмейера емкостью

250 мл и.по 100 мл в колбы Эрленмейера емкостью 500 мл и стерилизуют в течение 30 ьп н при 110 С ° Посевную культуру получают инокулированием в

250-миллилитровых колбах со скошенного агара культурой штамма В.Ьгечis и инкубируют, как в примере 4, при

40 С в течение 22 ч, Для инокулиров .ния эту культуру (оптическая плотность 0 105 при 550 нм, разбавление

1: 10) отбирают в количестве 2,5 мл

3 112488 в колбы Эрленмейера объемом 500 мл, содержащие ту же среду. По прошествии 15 ч инкубирования при 40 С реакционная смесь содержит в 64 мл буфера 100 мг бактерий (в пересчете на сухой вес и эквивалент 100 мл бульонной культуры) и 20 мкмоль/мл

5-(Р,Ь)-фенилгидантиона.

По прошествии 5, 10 и 15 мин проводят определение количества получен- 10 ного N-карбамилфенилглицина, которое соответственно равно 0,6; 1,0 и

1,4 мкмоль/мл.

Пример 6. Готовят нитательную среду, состоящую из воды от зама- 15 чивания кукурузы в количестве 2,67 (в пересчете на сухой вес). Среду доводят до рН 7,5 с помощью КОН, распределяют порциями по 50 мл в колбы емкостью 250 мл, а также порциями по

100 мл в колбы емкостью 250 и 500 мл с последующей стерилизацией в течение 30 мин при 110 С. Для получения посевной культуры производят инокулирование в колбах по 250 мл со скошенного агара с культурой штамма

В brevis .МВШ 1286 с последующим инкубированием, как в примере 4, при

40 С в течение 22 ч.

Для инокулирования среды в колбах по 500 мл отбирают по 2,5 мл полученной посевной культуры. По прошествии

18 ч инкубирования при 40 С получают покоящиеся клетки аналогично примеру 3.

Ферментативный гидролиз проводят при 40 С в реакционной смеси, содер" жащей в 64 мл 0,07 М фосфатного буфера (рН 9,5) бактериальные клетки, полученные из 100 мл бульонной куль<0 туры, и 20 мкмоль/мл 5-(N,L)-фенилгидантиона; в реакционной смеси, содержащей в 64 мл 0,07 M фосфатного буфера (рН 8, 5) бактериальные клетки, полученные из 100 мл бульонной куль" туры, и 20 мкмоль/мл 5-(N,L)-пара45 метоксифенилгидантиона.

По прошествии 5, 10, 15 и 60 мин определяют количество полученного таким путем N-карбамилфенилглицина и N-карбамилпараметоксифенилглицина, 50

Результаты представлены в табл.2.

Пример 7. Получают, ацетоновый порошок клеток штамма Bacillius

Ьгevis NRRL 1286, и 80 мг этого по9 б рошка, содержащего 420 ед. фермента, суспендируют в 1 л 0,2 М фосфатного солевого буфера (рН 8,5), содержащего 5,0 г 5-(D,L)-фенилгидантиона.

По прошествии одного часа при 50 С получают 4,8 г N-карбамилфенилглицина, что соответствует приблизительно 8?X полного гидролиза.

Пример 8. С использованием штамма Bacillus brevis NRRL 1286 получают биомассу в 20-литровом ферментаторе Fomel, содержащем 16 л культурной среды рН 7,8, имеющей состав, г/л:

Дрожжевой экстракт 10

Мясной пелтон 10

НаСХ 3

К НР04. 0,56

5-(D,1.)-Метилгидант.аин 1

Культур в ферментаторе инокулируют с использованием 16- мл посевной культуры (оптическая плотность

0,360 при 550 нм, разбавление 1:10), выращенной в 50-миллилитровых колбах, содержащих 100 мл той же питательной

-среды, и инкубированной в течение

16 ч при 40 С при перемешивании (220 об/мин) . Ферментацию проводят при рН 7,8 с добавлением 2н.HC R, при поддержании коэффициента О.А.Р. порядка 0,45. К 16-му часу ферментации (оптическая плотность 0,350 при

550 нм. разбавление 1:10) биомассу отделяют от культуральной жидкости с помощью центрифугирования в сеператоре фирмы "Альфа Лаваль" при комнатной температуре.

Клетки промывают изотоническим раствором при рН 8,0. Ферментативный гидролиз осуществляют при 40 С в реакционной смеси, содержащей в 64 мл

0,07 М фосфатного солевого буфера (рН 8,5) 0,5 г бактериальной суспензии (эквивалентно 0,120 r сухих клеток) и 20 мкмоль/мл 5-(D,L)-гидантоина, и в реакционной смеси, аналогичной вышеуказанной,но содержащей

20 мкмоль/мл 5-(D,L)"H-метоксифенилгидантоина. По прошествии 5, 10, 15 и 60 мин определяют количество полученного N-карбамилфенилглицина и N-карбаминпараметоксифенилглицина.

Результаты представлены в табл.3.

Таблица

1 t 24889

Характеристика штамма

0,6-1

2,0-3,5 длина

Эллипсоидная . Эллипсоидная форма спор

Подвижность

40-50

40-50

Катал аза

Уреаза

7Х-ном

Оптимум рН

Наименование показателей

Bacillus brevis

ЯКИ 1286

Палочки, мм: ширина

0,6-0,9

1, 5-4

Реакция Грама

Cr.ора

Субтерминаль° ное

Доминирующее положение споры

Иаксимальная температура роста, С

Минимальная температура роста, С

Аназробный агар

Гидролиз крахмала

Разложение казеина

Щелочная реакция в

У-Р бульоне

Отношение к нитратам и нитритам (ЯО,NO ) Рост в хлориде натрия:

ЗЖ-ном

Bacillus stearothermophilus

ЯКИ 1287

Субтерминальное

10! 124889

Та блица 2

Время, мин

Полученный Я- карбамилфенил— глицин

Полученный N-карбамил-и-метоксифенилглицин

Количество, мкмоль/мл

Конверсия „%

Конверсия, %

Количество, мкмоль/мп

6,55

6,45

32,8

32,3

55,5

10,9

54,5

14,85

15,05

75,5

74,2

19,8

19,85

99,0

99,2

Таблица 3

Полученный N-карбамил-й"метоксифенилглицин

Полученный И-карбамилфенилглицин

Время, мин

Количество, мкмоль/мп

Конверсия, %

Конверсия, %

Количество, мкмоль/мл

20,5

4,10

28,2

4,05

7,6

38,2

7,65

38,0

10,5

52,5

52,0

10, 4.

90,5

18,1

91,0

18,2

Заказ 8305/47 : Тираж 521 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета. СССР по делам изобретений и открытий

113035, Иосква, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г.ужгород, ул.Проектная, 4

Составитель И.Ларина

Редактор И.Рыбченко Техред С.Мигунова Корректор М.Иаксимишинец