Способ получения д-фенилглицина и его производных

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

Союз Советских

Социалистических

Республик

К ПАТЕНТУ (61) Дополнительный к патенту (22) Заявлено 220579 (21) 2770401/28 13 (51) M

3 (23} Приоритет — (32) 23.05. 78

С 12 P 13/00

Государственный комитет

СССР по делам изобретений и открытий (33) Италия (31) 45524

Опубликовано 2311,81,бюллетень М 43

Дата опубликования описания 2 1181 (53) УДК 668 394 (088.8) (72) Авторы изобретения

Иностранцы

Роберто Оливьери, Аурелио Вилья, Людвиг Деген, Леонелло Анджелинн и Эудженио Фасцетти (Италия) 1

Иностранная фирма

"Снампрогетти С.п.А" (Италия) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ Э -ФЕНИЛГЛИЦИНА

И ЕГО ПРОИЗВОДНЫХ

Изобретение относится к технике ,получения 0-фенилглицина и его произ водных и может быть использовано в микробиологической и фармацевтической 5 промышленности.

Известен способ получения оптически активных аминокислот путем ферментативного гидролиза их производных, например фенилглицина или его производного микроорганизма Agotobactes

Однако известный способ сложен и не предусматривает высокого выхода целевого продукта с необходимой оптической чистотой.

Известен также способ получения 0фенилглицина и его производных путем ферментативного гидролиза рацематов

5-фенилгидантоина и его производных (2).

Однако процесс ферментативногогид-20 ролиза по этому способу сложен, так как он ведется в несколько стадий.

Цель изобретения - упрощение процесса. . Поставленная цель достигается тем, 25 что согласно предлагаемому способу получения 0-фенилглицина и его производных путем ферментативного гидролиза рацематов 5-фенилгидантоина и его производных, ферментативный гидролиз рацематов 5-фенилгидантоина н era проиэводных осуществляют штаммом Адгоbacterium sp. NRRL В 11291.

Способ осуществляют следующим образом.

Ферментативный гидролиэ рацематов

5-фенилгидантоина и его производных осуществляют штаммом Ag robacte rium

sp. NRRL 8 11291.

Штамм Agrobacterium sp.NRRL В 11291 имеет следующие свойства.

Микроскопическая морфология образована дискретными стержнями, иногда спаренными, грамм-отрицательный, 0,8х х1,5-2,0 мк, капсулы и споры отсутствуют, передвижение с помощью 446 перитрихиальных жгутиков. Макроскопическая морфология образована колониями на агаровой питательной среде, выпуклые края равные, кремового цвета, прозрачные, диаметр 0,5-1 мм, поверхность гладкая, буйный рост на кальций глицерофосфат-манннт-агаре с побурением и образованием гало.

Биохимические свойства. Выращивание от 4оС до 39 С на всех простых лабораторных средах беэ ростовых факторов и аминокислот, используя NH

jN0 или аминокислоты в качестве

884576 единственного источника азота, оксидаза — положительно, каталаза — положительно, нитриты получены из нитратов.

Лакмусовое молоко — серо-коричневое.

Усвоение карбогидратов — окисление.

Штамм Адrobacterium sp. NRRL 8

11291 выделен Северным региональным научно-исследовательским центром Пеории, шт. Иллинойс (США) .

Микроорганизмы рода Ag rob ac t e r i um выращивают в аэробных условиях в куль-. туральной среде, содержащей источники азота, углерода, фосфора и мине-, ральных солей при температуре от .20 до 400С, предпочтительно от 26 до

350С, в течение от 10 до 48 ч, предпочтительно от 20 до 30 ч, при рН

6,0-8,0, предпочтительно от 7 до 7,5.

В качестве источников углерода ис7 р пользуют глюкозу, лактат, ацетат, лактозу и жидкость для замачивания зерна.

Источниками азота служат мясные гидролизаты, гидролизаты казеина и соевых бобов, соли аммония и мочевина, гидантоины и N-карбамоильные производные аминокислот. .Культуралъная среда содержит следующие ингредиенты, г: мясной пентон

5 мясной экстракт 5, глюкоза 5 и во- З да дистиллированная 1000 мл, рН равно 7,0-7,2.

О-аминокислоты получают непосредственно в ферментативной среде, содержащей ОL-гидантоин или ОL--N-кар- 3 бамоильные производные аминокислот, как в виде единственных источников азота, так и совместно с обычными ис- точниками азота.

D-аминокислоты получают также пу- 4 тем использования микробной суспензии в виде покоящихся клеток или ее экстрактов.

Экстрагирование из бактериальной суспензии ферментативных комплексов осуществляют известным способом, принятым в ферментологии. Клетки раз-. рушают в соответствующем аппарате, например во французском прессе с датчиком давления, гомогенизаторе Монтона Галинга, вращательных дезинтегра-.

° торах„ а также с помощью ультразвуковых вибраторов. Гидролиз гидантоинов или N-карбамоильных производных аминокислот осуществляют путем добавления в реакционную смесь фермента в следующих формах: свежие клетки; . клетки, выпущенные нри температуре ниже 00С модифицированные клетки ацетоновый порошок, либо .серые или очищенные экстракты.

Пример 1. Готовят бульон, содержащий следующие ингредиенты, r> мясной пентон 5; мясной экстракт 3; глюкоза 5 и дистиллированная вода

1000 мл. С помощью соды рН среды доводят до 7,2, после чего куль туральную среду разделяют на порции по 100 мл и каждую помещают в колбу

500 мл емкостью., Стерилизуют 30 мин при 110 С и в колбы засевают культуру штамма

Р 1302 из скошенного агара, содержащего ту же среду с добавлением

2Ъ-ного агара (DJFCO) и выращивают

24 ч при 30 С с перемешиванием при скорости вращения мешалки 220 об/мин.

Из этой предкультуры (Д.О. при

550 нм: 0,2504, х 1:10) высевают 1 мл в пять колб по 500 мл, содержащих

100 мл той же среды, после чего культуру выращивают при 30 С и перемешивании при 220 об/мин в течение 24 ч (Д.О. при 550 нм — 0,250 дл 1:10) .

Затем эти клетки собирают, промывают в физиологическом растворе и суспендируют в 100 мл ирофосфатного буферного раствора (0,1 м; рН 7,7), содержащего 10 г О, -5-фенилгидантоина, при 40 С под слоем азота Y о

РР., Через 200 ч выращивания при этих

5 условиях осуществляют полный гидролиз с образованием аминокислоты(Рфенилглицин), что отмечено посредством поляриметрического анализа реакционной смеси и тонкослойной хроматографии (проведенной в соответствии с методикой, описанной Сузуки в "Джорнал ов хроматографи" 80, 1973,, 199204).

О-фенилглицин выделяют из реакцион. ной смеси путем осаждения белков с помощью трихлоруксусной кислоты и отделения их центрифугированием, при этом рН доводят до изоэлектрической точки 5,8. Осадок промывают водой и высушивают в вакууме. Идентичность

0 О-фенилглициновой аминокислотыподтверж дается инфракрасным спектром и спектром ядерного магнитного резонанса.

„ дельная оптическая сила равна (с(=-154 (с=1% в 1 н растворе HCl) по сравнению с величиной О, равной

-157 8 для чистой аминокислоты (по литературным данным).

Hp и м е р 2 ° Клетки, полученные, как описано в примере 1, из р 100 мл бульонной культуры суспендируют в 10 мл пирофосфатного буфер-. ного раствора (0,1 М, pH — 7,7) и подвергают гомогенизации под воздействием ультразвука 10 мин при 5 С. Полученный гомогенат добавляют к 500 мл раствбра Д, -й-карбамилфенилглицина (20 мл) в пирофосфатном буферном растворе (0,1 М, рН-7,7) выращивают при 65 С. Кинетику реакции контролируют путем отделения ам40 мония, высвобожденного в процессе гидролиза М-карбамоила с использованием фенол-гипохлоридного метода.

После выращивания в течение 40 ч

NH -ион достигает концентрации

10 млмоль/Л, далее увеличения не

884576 выделяют и идентифицируют, как..описано в примере 2.

Удельное оптическое вращение равно

-157,2о и +171o по сравнению с известными значениями -161,2 и +175,4 о о для чистых продуктов (по литературным данным) .

Пример 5. Клетки штамма Agrobacteriurn sp. готовят, как описано в примере 1. Несколько грамм суспен эии влажных клеток взвешивают в пирофосфатном буферном растворе (0,1 М, рН 7,7) и обрабатывают ацетоном на холоде. Ацетон удаляют фильтрованием, ацетоновый состав высушивают в вакууме при 35 С до постоянного ве-. са. Высушенный материал гомогенизируют в ступке и порошок используют для испытаний ферментативной активности. Ацетоновый порошок анализируют на следующих субстратах: N-карбамоил-Ь (-)-аланин,N -карбамоил-D (-)валин, N-карбамоил-0 (-)глутаминовая кислота; й-карбамоил 0-(-) параоксифенилглицин, N-карбамоил0 (-) параметоксифенилглицин, N-карбамоил L(+)-фенилглицин; N-карбамоил- О(-)-фенилаланин; N-карбамоиЛ- (+) — глутаминовая кислота и Nкарбамоил-0 (-)(2-тиенил) -глицин.

Таким образом, получают 20 мл раствора каждого карбамоильного производного в пирофосфатном буферном растворе 0,1 М, рН 7,7, после чего к 10 мл каждого раствора добавляются соответствующее количество порошка, одинаковое для каждого субстрата. Выращивание проводят под слоем азота ЧРР при 40 С и перемешивании в течение

1 наблюдается. Реакционную смесь концентрируют в вакууме при .50 С до

100 мл. Добавлением HCI рН доводят до 5,8 и осадок собирают на фильтра-. те, а затем его растворяют в 1 н растворе HCI, повторно осаждают с помощью. МОй при рН 5,8 и высушивают. Далее определяют оптическое вращение, которое равно — 153 . Инфракрасный спектр подтверждает идентичность аминокислоты. (О

Из фильтрата, значение рН которого осторожно доводят до 2,5 добавлением Зн нормального раствора HG9 в ванне со льдом, получают осадок, который затем выпаривают до сухого состояния и экстрагируют абсолютно ( кипящим этанолом. После охлаждения используют спиртовой раствор, получая кристаллический осадок, который затем высушивают и исследуют методом тонкослойной хроматографии и инфрак- 20 расного спектра. Анализ подтверждает наличие чистого й-карбамоилфенилглицина.

Удельное оптическое вращение равно (ДЯ=134 (С=1% в 1 н растворе йаОН} 25 по сравнению с известным +137 (данные литературы) для g — энантиомера..

Пример 3. Из предкультуры, полученной, как описано в примере 1, засевают пять колб по 500 мл, в каж- Зо дой иэ которых содержится 100 мл среды, состоящей иэ 5"5-ного раствора жидкости для эамачивания зерна. Значение рН доводят едким натром до 7,8 и стерилизуют при 121 С 30 мин.

Культуру выращивают 24 ч при 30оС и перемешивании при 220 об/сын. Клетки отделяют центрифугированием, промывают пирофосфатным буферным раствором (0,1 М, рН 7,7), а затеи 40 суснендируют в 100 мл такого же буферного раствора, содержащего 10 r

5-параокси-D,L-фенилгидантоина, и выращивают при 40ОC под слоем азота

VPP. Через 160 ч выращивания осуществ-45 ляется полный гидролиз с образованием аминокислоты (параоксифенилглицин

-0(-)), что подтверждается полярометрическим исследованием реакционной смеси тонкослойной хроматографией по методике Сузуки.

Аминокислоту выделяют осаждением белков с помощью трихлоруксусной кислоты, которые затем удаляют центрифугированием при рН 5,2, доведенном до изоэлектрической точки. Осадок промывают водой и высушивают в вакууме.

Идентичность аминокислоты подтверждается на основании инфракрасного спектра и спектра ядерного магнитно- 60 го резонанса. Удельное оптическое вращение равно(.6 5-156,5 (С=1% в

1 н растворе НС1) по сравнению с .-161,2О для чистой аминокислоты по .литературным данным) . 65

П р и м р 4. Используют клетки штамма Agrobacterium, полученные из

100 мл бульонной культуры, содержа= щей в основе жидкость для замачивания зерна и приготовленной, как опи сано в примере 1 °

Промытые клетки суспендируют в

10 мл пирофосфатного буферного раствора (,0,1 M, pH 7,7)и модифицируют толуолом 15 мин при комнатной температуре и перемешивании. Суспензию добавляют к 500 мл раствора N -карбамоил-3,L-параоксифенилглицина 20 мм пирофосфатном буферном растворе (О 1 M рН 7,7) и выращивают при

65 С под слоем азота ltPP. Кинетику реакции контролируют определением аммония, высвобождаемого в результате гидролиэа N --карбамоильного производного в соответствии с методом фенол-гипохлорита, как описано в примере 1. Через.18 ч выращивания йН -ионы достигают концентрации

10 млмоль/л. Реакционную смесь концентрируют в вакууме при 50 С до конечного объема 100 мл. Концентрированной НС1 рН доводят до 5,2 образовавшийся осадок собирают на фильтре.

0-аминокислоту и й-карбамоил-L

884576

Активность, Ъ

Наименование субстрата

М-Карбамоил-b (-) -алании

М-Карбамоил-О (-) -валин

N-Карбамоил-D (-) глутаминовая кислота

N-Карбамоил- (+)глутаминовая кислота

57,5

34,25

21,7

100,0

81,25

М-Карбамоил-О (-) -параметоксифенилглицин

М-Карбамоил-О (-) -фенилглицин

М-Карбамоил-L (+) -фенилглицин с

N-Карб амоил- D (-) - (2-тиенил) глицин

М-Карбамоил-О(-)-фенилаланин

40,7

50,0

М-Карбамоил-D(-)- паратоксифенилглицин

40,0

1 ч после чего измеряют количество образовавшейся аминокислоты, определяемое измерением в реакционных смесях концентрации NH4 -иона с помощью ф метода фенол-гипохлорида, как описано в примере 2. 5

При испытаниях за 100 принимают гидролитическую активность в отношении к N -карбамоил — D(-) -параксифенилглицина °

Результаты испытаний приведены (p в таблице.

Пример б. Готовят культуральную среду следующего состава,г:

MgSO 7Н О 0,2; Ма НР04, 12 б;

К1НРО 3; NH4C1 2; NaCL 0,5; 1Я глицерин — 5, 5-фенил- ), -гидантоин0,1; дрожжевой экстракт 0,1 и дистиллированная вода 1000 мл.

По 100 мл среды помещают в колбы

500 мл емкостью, стерилизуют при

116 С 30 мин. Гидантоин стерилизуют о фильтрованием.

Из предкультуры, полученной, как описано в примере 1, засевают 5 мл на колбу, после чего эту культуру выращивают 36 ч при 30 С и перемешивании при 220 об/мин мешалки. Затем клетки отделяют центрнфугированием и из надосадочной жидкости выделяют аминокислоту путем ее концентрирования и доведения до изоэлектрической точки, Из 10 л обработанного таким образом бульона получают 11,2 г D (-) фенилглицина с удельным оптическим вращением (сЦ1 =-156 (с=1% в 1 н растворе НС1) по сравнению с известным, равным — 157,8 для чистой аминокислоты (по литературным данным) .

Пример 7. Готовят культуральную среду состава,г: HgS04. 7Н10 40

0,2; NayHP04 ° 12Н) 0 б; К1НР04. 3;

5-метил-гидантоин 2, NgC9 0,5, глюкоза 1; дрожжевой экстракт 0,1 и дистиллированная вода 1000 мл; рЙ 7.

Культуральную среду порциями по

100 мл помещают в колбы емкостью

500 мл, стерилизуют при 116 С 20 мин, метилгидантоин стерилизуют отдельно. из предкультуры, полученной, как описано в примере 1, высекают по

5 мл на колбу, после. чего культуру выращивают при 30 С и перемешивании при 220 об/мин мешалки в течение

24 ч..

Клеточную суспенэию отделяют центрифугированиим из 100 мл среды, промывают в фосфатном буферном растворе (pH 7,5) и повторно суспендируют в 100 мл такого же буферного раствора, содержащего 4 г D,1.-5- 2-тиенил -гидантоина.

> реакционную смесь выращивают под слоем азота Y PP при 40 С. Через

30 ч реакции гидролиэ завершается с образованием аминокислоты2(-) †- (2тиенил-глицерина, которую выделяют путем концентрирования реакционной смеси до объема 20 мл и рН до 5,6, Идентичность аминокислоты подтверждается инфракрасным спектром и спектром магнитного резонанса. удельное оптическое вращение(А) =

=-72,60 (C=1% в HgO) по сравнению с -73,7 для чистой аминокислоты (по литературным данным) .

Таким образом, штамм AgrobacteriUm продуцирует ферментный комплекс, который вызывает как гидролиз гидантоина до карбамильного производного целевой аминокислоты, так.и гидролиз такого производного в соответствующую D -аминокислоту.

Предлагаемый способ получения D— фенилглицина и его производных обеспечивает получение последних одностадийно, что упрощает процесс, по сравнению с известными решениями той же задачи.

884576

Формула изобретения

Составитель А.Бражникова

Техред М.Надь Корректор М.Пожа

Редактор Н.Кончицкая

Заказ 10271/89 Тираж 531

ВНИИПИ Государственного комитета СССР . по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5

Подписное

Филиал ППП "Патент", г..ужгород, ул.Проектная,4

Способ получения Я -фенилглицина и. ceo производных путем ферментатив- ,нбго гидролиза рацематов 5-фенилгидан. тонна и его производных, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью упрощения процесса. Феоментативный гидролиэ рацематов 5-фенилгидрантоина и его производных осуществляют штаммом Agrobacterfum p. NRRL 8

11291.

Источники информации, т ринятые во внимание при экспертизе, 5 1. Патент Японии Р 45-8635, кл.. С 12 D 13/06,. опублик.1970;

2. Патент СССР по заявке

9 2381854/28-13, 1976.