Способ получения l-триптофана

 

Н. И. Жцанова, Л. А. Музыченко, А. Ф. Колин, Г. А.—..Ввликжанина, Ж. А. Банннкова, Е. Р. Рошаль, Л. Jl. Альховская, . В „Апафеем" =-=-==. и В. А. Русинов г ", J ,< . ", У Ч м „;, Всесоюзный научно-исследовательский институт геленки к.селекции промышленных микроорганизмов:" -- -. (72) Авторы изобретения (7! ) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 1 — ТРИПТОФАНА

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к способу получения незаменимой аминокислоты L-трннтофана, применяющемся в фармацевтической промышленности и медицине при нриготовлении содержащих свободные аминокислоты смесей для парентерального питания, для обогащения белковых гкдролизатов, используемых в тех же целях, а также может быть применен в качестве добавки для балансирования состава кормов в живодноводстве.

Из известных микробиологических способов . получения L-трнптофана наиболее экономически выгодным является метод с нркмене- 15 пнем микроорганизмов, способных продуцировать триптофан на основе прямой фермента-. ции иэ простых источников углерода и азота без введения в среду предшественников три то фана, например индола кли антракиловой кислоты. При этом в качестве источника:углерода используют мелассу, гидрол или технический сахар, в качестве источника азота мочевину, соли аммония, а также необходимые ростовые добавки и минеральные соли.

При получении кристаллического L-триптофана высокой степени чистоты для медицинских целей значительно усложняется технология его выделения, что.приводит к. снижению конечного выхода продукта и увеличению расходов на его дополнительную очистку, в связи с чем эффективность любого способа получения триптофана оценивается с учетом стадии ферментации и стадии выделения кристаллического препарата.

Известен способ получения триптофана путем культивирования мутантных -штаммов Corynebacterium gtutamicum на средах, не содержащих предшественников этой аминокислоты требующих для роста биотнн, фенилаланкн, ткрозин, и резистентные, по крайней мере, к одному из аналогов триптофана и к одному из аналогов фенилаланина или тирозина }t}.

На среде с глюкозой и источником ростовых факторов (Я-амин) уровень образова-, ния тркптофана с культуральной жидкости

9908

3 достигает З,б г/л за 4 сут культивирования.

На среде с мелассой, кукурузным экстрактом и гидролизом соевого широта уровень образования триптофана достигается 3,4-16,8 г/л за 3 — 4 сут культивирования. Кристаллический триптофан в известном способе выделяют с помощью сильнокислотного катионита с выходом 50% из культуральной жидкости, содержащей глюкозу, как источник углерода.

Для сред, содержащих мелассу, показатели, 10 характеризующие процесс выделения триптофана, отсутствуют, что связано очевццно с недостаточно эффективной очисткой триптофана, от других аминокислот, которые накапливаются в процессе ферментации или присутствуют в исходной ферментационной среде (например, если среда содержит мелассу).

Известен также способ выделения триптофана, пз культуральной жидкости, включающий селсктивную сорбцию триптофана на слабоосновном анионите с последующей его десорбцией водой или слабым раствором кислот и повторной сорбцией из этого раствора с целью концентрирования на сульфокати-2> оните в Н+-форме, и обеспечивающий выход кристаллического продукта до 70% в зависимости от требуемой чистоты конечного препарата (21.

Недостатками известных способов получения L-триптофана и способа его выделения из ку)гьтуральной жидкости микроорганизмов является: потребность в нескольких ростовых факторах для штаммов Сог . glutamicuiYl„BTG вызывает необходимость введения в питательную среду источников этих факторов, в частности гидролиэатов бепка; большая длительность процесса культивирования микроорганизмов 72 — 96 ч;

40 низкий уровень накопления триптофана на стандартных источниках углерода (глюкозе, сахаре), которые наиболее пригодны для эффективного выделения кристаллического триптофана, тогда как меласса и гидрол относясь к видам сырья с непостоянным составом компонентоВ, влияющих на рост микроорганизмов и биосинтез, не обеспечивают стабильных показателей на стадии ферментации, и снижают эффективность выделения кристаллического продукта высокой степени чистоты вследствие значительных примесей пигментов, минерапьных солей, аминокислот и оксикислот и т.д.; относительно низкий выход (50%) кристаллического триптофана на стадии выделения из культуральной жидкости.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту к предлагаемому

14 4 является способ получения L-триптофана путем глубинного культивирования штаммов

Bacillus subtilis Ген-557/и или 2282 на питательной среде, содержащей углеводы в качестве источника углерода, источники азота, фосфора, ростовые вещества и другие необходимые минеральные соли в условиях аэрации среды с последующим вьщелением (-триптофана одним иэ известных способов с помогцью ионного обмена и кристаллизацией аминокислоты (3).

Недостатками известного способа являются невысокий уровень накопления триптофана на глюкозе и сахаре и большая продолжительность ферментации(на среде с техническим сахаром уровень образования триптофана достигает 4,6 г/л, на среде с мелассой или гидролом 8,2 — 10,1 г/л за 72 ч культивирования).

Целью изобретения является повышение выхода L-триптофана.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения L-триптофана, предусматривающему глубинное культивирование продуцирующих его микроорганизмов вида Bacillus subtilis в условиях аэрации на питательной среде, содержащей углеводы в качестве источника углерода, источники азота, фосфора, ростовые вещества и необходимые минеральные соли, с последующим выделением целевого продукта из культуральной жидкости с помощью ионного обмена и кристаллизацией, из микроорганизмов вида Bacillus

subtilis используют штамм Bacillus subtilis

ВНИИгенетика-15, при этом в процессе культивирования в среду вводят концентрированную питательную добавку, содержащую источники углерода, неорганического азота и ростового вещества, в количестве, обеспечивающем поддержание концентрации растворенного кислорода в среде 10 — 40%.

Сущность способа заключается в культивировании нового штамма Bacillus subtilis

ВНИИгенетика - 15 на питательной среде, содержащей источники углерода, азота, минеральные соли, в условиях аэрации при подаче в процессе культивирования питательной смеси с последующим вьщелением образовавшегося в культуральной, жидкости L-триптофана ионообменным способом. В качестве источника углерода используют технический сахар. На заключительной фазе роста через

12 — 30 ч после начала ферментации в ферментер дополнительно вводят питательную добавку, содержащую источник углерода азота и ростовое вещество таким образом, чтобы концентрация растворенного кислорода не превышала 40%.

990814

Использование нового штамма ВНИИгенетика-15 в сочетании с введением подпитки в ходе ферментации позволяет увеличить скорость биосинтеза L-триптофана и повысить уровень его накопления в среде с использо- 5 ванием сахара (нли сахарозы) в качестве источника углерода. Через 48 ч культивирования при 37 С уровень накопления L-триптофана в культуральной жидкости достигает

10,8 г/л. При выделении 1.-триптофана по- IÎ следовательно используют слабоосновной анионит конденсационного типа и сульфокатионит в Н-форме. Выход кристаллического, 1-триптофана составляет 65 — 75%.

Новый штамм Вас. subtilis ВНИИгенети- 15 ка-15 получен из известного штамма Вас.

subtilis.Ген-3557 путем ступенчатой селекции, включающей обработку клеточной суспензии мутагенным фактором N-метил-й-нитроэо- N- гуанндином (концентрация 200 мг/мл, 20 экспозиция 20 мин) и получение мутантов, резистентных к структурным аналогам аминокислот. На 1 ступени отбора обработанные мутагеном клетки штамма Ген — 3557 были высеяны на минимальную среду, содержащую 25 аналог гистидина 1 — 1-метнлгистидии в концентрации 5 мг/мл.

Среди выросших резистентных колоний был отобран штамм 924, клетки которого после воздействия мутагеном были высеяны на 5» среду, содержащую следующую смесь аналогов триптофана, фенилаланина, тирозина:

5-фтортриптофан (2 мг/мл), феннлаланигидроксамат (0,5 мг/мл) и тирозингидроксамат (2,5 мг/мл). Из числа колоний, резистентных и указанной смеси аналогов аминокислот, был отобран штамм 22 — 13. Клетки штамма

22 — 13 были снова обработаны мутагеном и. высеяны на среду, содержащую смесь тех же аналогов аминокислот, но s концентра- 4П ции 2,5 мг/мл, 0,5 мг/мл, 2,5 мг/мл соответ. ственно. Из числа колоний, резистентных к указанной смеси аналогов, бьш вьщелен штамм ВНИИгенетика-15.

В табл. 1 приведены сравнительные данные

45 об уровне накопления триптофана при ферментации в колбах на среде с сахарозой у исход. ного штамма Ген-3557 и нового штамма

ВНИИгенетика-15. В указанных условиях выход триптофана в конце ферментации у ноЮ вого штамма ВНИИгенетика-15 превышает выход аминокислоты .у исходного штамма на 45%.

Высокий уровень накопления L-.òðèïòîôàíà (9 — 11 г/л) у штамма ВНИИгенетика-15 может быть достигнут за 48 ч при культивиро55 вании в ферментере с введением питательной подпитки в ходе ферментации согласно предлагаемому способу.

Штамм Bacillus subtilis ВНИИгенетика- IS хранится в Центральном музее промышленных микроорганизмов института "ВНИИгенетика", где он депоннрован под номером ЦМПМ-В2306. Штамм Bacillus subtilis ВНИИгенетика15 имеет следующую культурально-Морфоло- гическую характеристику.

Грамположительная спорообразуюшая папочка. Колонии на мясо-пептонном агаре после

24 ч инкубации при 37 С достигают 4-5 мм в диаметре, сплошные, круглые, с!йзрезанным краем, поверхность гладкая, со слабой, радиальной по краю и концентрической в центре исчерченностью, цвет серовато-белый. Посев штрихом на мясо-пептонном агаре после

24 ч инкубацин при 37 С дает умеренный рост, штрих-широкий с мелкозубчатым краем, запах — характерный,,консистенция — маслянистая, цвет — серовато-белый. Рост на мясо-пептонном бульоне после 1 сут. ннкуба- . ции при 37 С характеризуется умеренным помутнением среды без образования пленки, запах — характерный, осадок — скудный, тягучий нри встряхивании.

На агаризованной минеральной среде Сцицайзена с глюкозой колонии после 3-х суток ннкубации, при 37 С достигают 1,5—

2,0 мм в диаметре, сплошные, круглые, с гладкой, блестящей поверхностью, .грязнобелого цвета, структура однородная.

Рост на жидкой минеральной среде ицайзена (24 ч инкубации при 37 С на к чалке) характеризуется слабым струйчатым помутнением. среды. Рост штамма ВНИИгене тика-15 на жидкой или агаризованной минимапьной среде не стимулируется 1-фенилаланином, в отличие от исходного штамма

Ген-3557.

Способ осуществляют следующим образом.

Штамм Вас. subtilis ВНИИгенетнка-15 выращивают в течение суток на агаризованной среде (МПА), пересевают в колбы со стерильной питательной средой, содержащей источники углерода, азота, ростовых веществ и необходимые минеральные соли, и выращивают в течение 18 — 24 ч на качалке, обеспечивающей достаточную азрацию при температуре

28 — 30 С в асептических условиях.

- Полученный посевной материал в количестI ве 1 — 10 o передают в ферментер со стерильной питательной средой, содержащей источники углерода, азота, ростовых веществ и необходимые минеральные соли. В качестве источника углерода используют сахарову или содержащие ее субстраты, например технический сахар, js качестве источника азота — мочевину, в качестве источника ростовых вешеств— кукурузный экстракт.

990814

20,0

2,25

55

Ферментер снабжен датчиком концентрации растворенного кислорода, устройством для аэрации, перемешивания, поддержания темпе-, ратуры, отбора проб и подачи дополнительной питательной добавки в ходе ферментации.

Ферментацию осуществляют в течение 48 ч при температуре 35 — 40 С, рН 6 — 8, непрерывной аэрации и перемешивании.

В начале процесса ферментации в связи с интенсивным ростом биомассы концентрация 10 растворенного кислорода падает, а затем начинает возрастать. Через 12 — 30 ч после начала ферментации при увеличении концентрации растворенного кислорода р02 выше 40 o от насыщения воздухом при атмосферном дав- 1з ленни в фсрментационную среду вводят концентрированную питательную добавку, содержащую источник углерода, азота, ростовых веществ. Добавку вводят таким образом, что бы концентрация растворенного кислорода г0 р02 не превышала 40%. За 48 ч ферментации концентрация L-триптофана в культуральной жидкости достигает 9 — 11 г/л. Полученную

- культуральную жидкость обрабатывают последоватешно известковым молоком и серной д кислотой с целью отделения биомассы путем фильтрации или центрифугирования. Затем выделение кристаллического L-триптофана осущсствляют известным способом, с последовательной сорбцией L.триптофана на слабооснованном анионите конденсационного -типа и сульфокатионите а Н-форме.

П р и м с р 1 (контрольный) . Для приготовления посевного материала суточную культуру штамма Вас, subtiHs ВИИИгенетика35

15, выращенную на агаризованной среде (МПА), псресевают в колбы емкостью 750 мл, содержащие 40 мл стерильной посевной среды.

Посевная среда имеет следующий состав, %:

Сахар технический 5,0

Кукурузный экстракт (по техническому весу) 2,0

КН2 1 О 4 0,06

К2 111 О 4 0,14

pH=7,0 — 7,2

Среду стерилизуют при 0,8 атм в течение

30 мин. Посевной материал выращивают

18 — 20 ч на качалке (200 — 300 об/мщу) при

28 — 30 С.

Для засева ферментационной среды посевной материал добавляется в количестве 5%.

Ферментационная среда имеет следующий состав, о.

Сахар технический 10,0

Кукурузный экстракт (по техническому весу) 3,0

КН2 1 О4 0,06

Кг НРО4 0,14

MgSO4 ° 7Нг О 0,1

NaCI 0,015

Мочевина 0,5 рН=7,0 — 7,2

Ферментационную среду без мочевины стерилизуют при 0,8 атм в течение 30 мин. Мочевину в виде 25 -ного раствора стерилизуют отдельно при 0,5 атм в течение 30 мин и добавляют в основную среду перед посевом.

Ферментацию проводят методом глубинного культивирования в колбах Эрленмейера (емкостью 250 мл с двумя отбойниками), содержащих 20 мл среды на качалках (400 об/мин) при t = 37 С в течение 48 ч.

Через 48 ч в культуральной жидкости накапливается 7,5 г/и L-триптофана.

Пример 2. Штамм-продуцент, состав посевной и ферментационной сред тот же, что и в примере 1. В отличие от способа ведения ферментации, описанного в примере

1, культивирование проводят с дробной подачей подпитки в зависимости от содержания растворенного кислорода в среде.

Подпитка имеет следующий состав, %:

Сахар технический 50,0

Кукурузный экстракт

Мочевина рН=7,2 — 7,3

Подпитка стерилиэуется при 0,8 атм в течение 30 мин. Мочевина стерилизуется отдельно в виде 25 o-ного раствора при 0,5 атм в течение 30 мин.

В ходе ферментации содержание растворенного кислорода (р02) в среде снижается до нуля, затем возрастает. При повышении рО2 до 40% подается подпитка в количестве, вызывающем снижение р02.

Подачу подпитки начинают через 1930 ч ферментации. Объем затраченной подпитки 44 мл. Динамика накопления триптофана в культуральной жидкости показана в табл. 2.

Пример 3. Штамм-продуцент, состав посевной и ферментационной среды и подпитки тот же, что и в примере 2. Ферментацию ведут в ферментере объемом 30 л, .коэффициент заполнения 0,5. Условия перемешивания и аэрации обеспечивают сульфитное число 3,5 г Ог/л ч. В ходе ферментации содержание растворенного кислорода (р02) снижается до нуля, затем возрастает, При достижении значения р02, равного 40%, включают подачу подпитки, которую .подают в аппарат до тех пор, пока р02 не снижается до 15%. Подачу подпитки начинают на 28 ч

9 990&14 10 ферментации. Объем подпитки, потребленныи довательно соедин о е еиных колонн 3 ИА, 1 КУ в течение ферментации, равен 450 мл. и 2 КУ: (колонна 2 ИА отсоединяется и сор.

После 48 ч ферментации в культуральной бент регенерируется).жидкости накапливается 9,7 . г/л 1.-триптофа- Элюирование триптоф офана с колонны 1 КУ на, который выделяют следующим образом. ч ведут водно-этанольным раствором аммиака

70 г . После об ботки

1 л культуральной жидкости, освобожденной . при температуре 70 С. П ра от биомассы, с концентрацией триптофана "богатой" фракции элюата уксусной кислотой

9,7 г/л направляют на колонну с 0250 л и охлаждения до 0 С получают кристаал сорбента ИА=lр — слабоосновного анионита:1.-триптофаиа. После высушиваиия при темпекондецсационного типа (колонна IИА). щ ратуре 50 С получают 17,2 r Л=триптофана

Перед промывкой к выходу колонны I HA с содержанием о е жанием основного вещества более

99 о. осле описанных опеоаций по выделеподсоедиияют вторую колонну с ИА-lр (ко- 99%. После о .лонна 2 ИА содержит.0,250 л сорбента). По нию трилтофана из трех литров культуральокончании промывки колонну 2 ИА отсоеди- ной жидкости ной жидкости на колоннах 3 ИА и 2 КУ няют, а к выходу колонны 1 ИА подсоеди- 1g остается сор ро р ф т со би ванный т жпойан в колиняют колонну с сульфокатионитом КУ вЂ” 2 — 8 честве 35 г. Триптофан также содержится

ых™ акци аммиачного элюата и (колоина 1 КУ содержит 0,1 л. сорбента) и . в бедных фр ях в аммиачно-этанольном маточнике полученпроводят элюирование. Промывку колонны

1 ИА и элюированне из нее триптофана осу- ном после отделения кристаллов триптофады, соответственно. Дальнейшее элюирование на, который может быть довыделенв после» триптофана из колонны ф 1 ИА т асеево. дУющих технологических циклах, о щий выведут раствором, выходящим из колонны . ъем1 КУ. Об - ход трилтофана составляет 70%. Преимущества п дложенного.способа состоят в том, что ная скорость пропускания раствора, цирку- . предло в способе достигается значительная экономия пирующего по системе из двух колонн, состав-д в с ляет 0,25 л/ч, продолжительность указанной обессоленной водь, ой во аммиака и этанола за счет того, что малоконцентрированные фракоперации составляет 10 ч.

Очередную порцию (1 л) культур уральной . цнн элюата используют в качестве элюента жидкости найравляют на колонну 2 ИА. Пе- в последующих технологических циклах для ред промывкой ко входу колонны нны подсоеди- десорбции t.-триптофана с анионита и сульфо30

1 ИА а к выходу — третью катионита. За счет этого удается также сниняют колонну 1 ИА, а к выходу— одукта при выделении. Позить потери продукта колонну с ИА — р (колонн л ченные богатые фракции элюата нейтрали025 л со бента). По окончании промывки лученные г

7 р ).

ИА - зуются уксусной кислотой при охлаждении, колонны 2 ИА д

ИА во ой колонну 3 отсоедисое - п и этом триптофан выпадает в виде крисняют а к выходу колонны. 2 ИА подсоеди- при этом три т

Ъ нт во ) взятый таллов, которые выделяют фильтрованием няют колонну 1 КУ. Элюент (воду), взятыи в количестве 2,5 л, про у р п скают че ез после- и высушивают. аточный р

ы 1лл 2ИА .ют для сор ции на коло доватсльно - соединенные колонны 1 1М, б- Суммарный выход трипто ана о ф д стигает и 1 КУ. Дальнейш альнейшее элюи вание (пересор (70%. Содержание основного вещества в полуцию) тринтофана из колонны IИА нны О ченном препарате не менее, а п на колонну 1 КУ ведут, соединя коло

2 ИА и 1 КУ, в замкнутую систему.-Сорбент . кристаллиз ции к исталлизации не более 9 т егенз ации. Предлагаемый способ получения 1.-триптов колонне 1 ИА подвергают регенерации. фана имеет следующие преиму е мущества по сравОчередную порцию культуральиои жиднению с известными способамн: кости (lл) обрабатывают аналогично выше3 ИА 4 более высокий уровень накопления триг писанном с использованием колонн тофана на средах со стандартным источником

1 ИА (смола отрегенирована, колонна под(9 — ll г) ь 3ИА углеводов — сахарозой или сахаром — г соединяется к выходу из колонны п и и мывке, 2 ИА (подсоединяется ко по сравнению с З,б — 4 6 г/л); э и - сокращенный период ферментации, достигаевходу колонны 3 ИА при промывке и элюиро- со р вве ением питательной д авки (ч

Ьб (48

ИА и и элюировании). "Пересорб- по сравнению с 72 ч); т по соединив к в спосо е усове б ершенствована стадия выделецию триптофана проводят, д

Е.- птофана что позволяет в ю колонну с . ния и очистки }-трипт ана, что выходу. колонны l КУ другую ни ньшать расходы обессорбентом КУ вЂ” 2 — 8 (колонна 2 КУ содержит значительнои степени уме

0,1 л сорбента). Таким образом, раствор % соленной воды, аммиака н других реагенциркулирует по системе, состоящеи иэ после- тов на этой стадии.

990814

Таблица 1

Штамм

Выход L-триптофана после 48 — 68 ч ферментации в колбах емкостью 250 мл .при 37 С на среде с 10% сахарозы, 10 мл среды, г/л

48 ч

68 ч

Ген- = 557

6,1

6,6

ВНИИгенетика-15

7,3

9,6

Таблица 2 — — — — — а12 36

10,7

8,6

2,0

6,4

Т/t

0,17

0,22

0,29

0,232

При м е чан не, t — время ферментации;

Т вЂ” уровень накопления L-триптофана;

Т/t — скорость накопления.

Формула и зобретения при этом в процессе культивирования в среду вводят концентрированную питательную

Способ получения L-триптофана путем глу- эо добавку, содержащую источники углерода, бинного культивирования продуцирующих его неорганического азота и ростового вещества, микроорганизмов вида Bacillus subtilis в в количестве, обеспечивающем поддержание условиях аэрации на питательной среде, содер- концентрации растворенного кислорода в

>кащей углеводы в качестве источника углеро- среде 10 — 40%. да, источники азота, фосфора, ростовые ве цества и необходимьп: минеральные соли, с последующим выделением целевого продукта из культуральной жидкости с помощью ионного обмена и кристаллизацией, о т л и ч а ю ш, и и с я тем, что, с целью повышения выхода l -rp«w. офана, из микроорганизмов вида Bacillus subtilis используют. штамм Bacillus subtil is ВНИИгенетика-15, Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Патент США Р 3849251, кл. 195 — 29, олублик. 1974.

2. Авторское свидетельство СССР N 745889, кл. С 12 P 13/22, 1977.

3. Авторское свидетельство СССР N 480758, кл. С 12 Р 13/22, 1972.

Составитель М, Ларина

Техред Т.Маточка Корректор А, Ференц

Редактор Г.. Волкова

Тираж 521 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж вЂ” 35, Раушская наб., д. 4/5

Заказ 57/37

Филиал ППП "Патент", г, ужгород, ул. Проектная, 4