Способ определения противостафилококковой антитоксической активности сыворотки крови

 

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРОТИВОСТАФИЛОКОККОВОЙ АНТИТОКСИЧЕСКОЙ АК% гемо/гиз эр. 60 40 20 ТИВНОСТИ СЫВОРОТКИ КРОВИ путем определения степени .нейтрализации после-, довательных разведений токсина испытуемой сывороткой по гетяолизу эритро цитов, о тлич ающий ся тем, Что, с целью повышения его точности, и сокращения времени определения, реакцию гемолиза останавливают через 112 мин инкубации раствором глютаральдегида , неразрушенные эритроциты осаждают, а степень гемолиза в над ;рсадочной жидкости определяют с помош;ью фотоэдектрокодориметра по величи не антитоксической активности сыво ротки по калибровочным кривым. (/) ОО 00 Токсин J ГС О

COOS СОВЕТСНИХ

033 Ю

РЕСПУБЛИН

„S0ÄÄ11 8126

4 (51) А 61 В 10/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ/

,б гегщлиу ф1

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЦТИЙ (21) 3538927/28-13 (22) 12.01.83 (46) 07.02.85. Бюл. 11 5 (72) Г. Я. Левин, И. Л. Гольберг, С. Б. Кораблев и С. И. Пылаева (71) Горьковский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии (53) 615.373(088.8) (56) 1. Выгодчиков В. Г. Микробиология и иммунология стафилококковых заболеваний. И., Иедгиз, 1950, с. 127-!

ЗО. (54)(57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРОТИВОСТАФИЛОКОККОВОЙ АНТИТОКСИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ СЫВОРОТКИ КРОВИ путем определения степени, нейтрализации после-. довательных. разведений токсина испытуемой сывороткой по гемолиэу эритро" цитов, отличающийся тем, что, с целью повышения его точности. и сокращения времени определения, реакцию гемолиза останавливают через

12 мин инкубации раствором глютаральдегида-, неразрушенные эритроциты осаждают, а степень гемолиза в над-.

:,осадочной зхщкости определяют с помощью фотоэлектроколориметра по величине антитоксической активности сыво ;ротки но калибровочным кривым.

1138126

25 экстинкция надосадочной,жидкости

)< 100X. экстинкция надосадочной жидкости и осадка

Изобретение относится к области медицины, а именно к бактериологии.

Известен способ определения антитоксической активности сыворотки крови по В.Г.Выгодчикову, основанный на нейтрализации испытуемой сывороткой гемолитических свойств стафилококкового токсина jlj.

Однако известный способ недоста точно точен и при постановке занимает 10 много времени (4,5 ч), поскольку является полуколичественным и позволяет определять интервалы определяемой активности лишь в пределах 1-2 АЕ для высоких титров и 0,25-0,5 АЕ для ми- 15 нимальных титров антитоксической сыворотки. В клинике зачастую антитоксическая активность сыворотки превышает эти пределы и требуется дополнительное определение, 20

Целью изобретения является повышение точности способа и сокращение времени определения противостафилококковой антитоксической активности сыворотки.

Укаэанная цель достиГается тем, что согласно способу определения противостафилококковой антитоксической активности сыворотки крови путем определения степени нейтрализации последовательных разведений токсина испытуемой сывороткой по гемолизу эритроцитов, реакцию гемолиза останавливают через 12 мин инкубации раствором глютаральдегида, неразрушен- 35 ные эритроциты осаждают, а степень гемолиза в надосадочной жидкости определяют с помощью фотоэлектрокалориметра по величине антитоксической активности сыворотки по калибровоч- 4О ным кривым.

Способ осуществляется следующим образом

В трех пробирках разводят три токсина различной силы. Для этого стан- 4 дартный токсин с известной силой ЕН доводят до титра, указанного на этикетке (берется количество токсина, .Ф J

По калибровочной кривой определяют антитоксическую активность испытуемой сыворотки в антитоксических единицах соответствующее его LH и доводится до 1 мл физиологическим раствором).

Из основного раствора токсина готовят три его разведения, для чего к

5 мл физиологического раствора добавляют 2 мл токсина (первое разведение 0,4 LH), 0,5 мл токсина (второе разведение О,) LH) и 0,2 мл токсина (третье разведение 0,04 LH). Испытуемую сыворотку в количестве 0,15 мл разводят в два раза физиологическим раствором (рН 7,4). Эритроциты кролика, дважды отмытые физиологическим раствором,. разводят 1:2. В три пробирки добавляют по I мл различных разведений токсина, по 0,1 мл испытуемой сыворотки и по 0,1 мл разведенных эритроцитов. Пробирки немедленно номещают в водяную баню при 37 С. Через .12 мин гемолиз эритроцитов останавливают путем добавления в каждую пробирку по О,l мл 0,15Х-ного раствора глютаральдегида. Время инкубации подобрано опытным путем, как наиболее оптимальное, Пробирки центрифигируют в течение 5 мин при 1500 o6/мин. Надосадочную жидкость сливают в три пробирки, содержащие по 2 мл О,1 н. раствора соляной кислоты. К осадку добавляют по 4 мл 0,1 н. раствора соляной кислоты Во всех пробирках образуется стойкий раствор хлоргемина, насыщенность которого измеряют с помощью фотоэлектроколориметра (ФЭК) с использованием светофильтра (6), И связи с тем, что концентрация стандартных эритроцитов может несколько отличаться в различных исследованиях и даже в отдельных пробирках, за 1007. гемолиза (контроль) принимается сумма экстинкции раствора хлоргемина в осадке и надосадочной жидкости каждой пробы. Это еще больше повышает точность предлагаемого способа.

Затем рассчитывают процент гемолиза эритроцитов в надосадочной жидкости по следующей формуле: (АЕ) . Полученный результат следует удвоить, так как сыворотка была разведена в два раза, 1! 38126 разведениями противостафилококковой стандартной сыворотки (Центрального контрольного института) с известной антитоксичеекой активностью: 4 5;

3,0; 2,25; 1,125; 0,56; 0,28; 0,14;

0,07 АЕ. Токсин смешивают с сыво- . ротками активностью 4,5; 3,6; 2,25;

1,125 АЕ; токсин 2 — с сыворотками

1,125; 0,56; 0,28,АЕ; токсин 3 — с сыворотками 0,28; 0,14; 0,07 АЕ (фиг. 1-3).

0,60 (экстинкция надосадочной жидкости)

0,60 (экстинкция надосадочной жидкости) + 0,59 (экстинкция осадка) I

По второй калибровочной кривой, по- как при низких значениях антитоксистроенной для второго токсина, ак- 45 ческой активности испытуемой сывороттивность сыворотки крови больного Гi ки (менее 0,4 АЕ) гемолиз будет пол0,525х2 = 1,05 АЕ (результат удвоен, ным в смесях во всеми разведениями так как сыворотка разводилась в два токсина, что сделает невозможным опраза). Время осуществления способа ределение степени завершенности реак40 мин. 50 ции н антитоксической активности.

При очень высокой активности испы- Уменьшение времени инкубации, напритуемой сыворотки (более 9-10 АЕ),что мер, до 1! мин приведет к сокращению встречается крайне редко и видно по интервала одномоментно определяемой отсутствию гемолнза со всеми тремя антитоксической активности сывороток токсинами, сыворотку надо развести не> от 9 (при 12 мин инкубации) до 3-4 А1 в два, а в четыре раза. (при !I мин инкубации). Так, например, Увеличение времени инкубации, на- смесь любого из трех токсинов (даже пример, до 13 мин недопустимо, так самого сильного) с сывороткой 5 АЕ

С целью ускорения метода после центрифугирования трех пробирок для растворения в соляной кислоте и последующего колориметрирования выбирается лишь одна пробирка, в которой гемолиэировалась лишь часть эритроцитов. Например, при высокой аититоксической активности сыворотки (2,25

9,0 АЕ) в первой пробирке (токсин

0,4 1.Н) гемолиз частичный, во второй (токсин О.,! LH) и в третий (токсин

0,04 LH} пробирках гемолиза нет.

При средней антитоксической активности сыворотки (0,56 — 2,25 АЕ) в первой пробирке гемолиз полный, во второй — гемолиз частичный, в третий— гемолиэа нет. При низкой антитоксической активности сыворотки (0,14—

0,56 АЕ) в первой и второй пробирках гемолиэ полный, в третьей — частичный.

Поскольку разница в суммарной оптичеекой плотности осадка и надосадочной жидкости в различных опытах колеблется в незначительных пределах, для еще большего ускорения метода возможно определение экстинкции лишь иадосадочной жидкости, а расчет степени гемолиза производится из расчета средней суммарной экстинкции осадка и надосадочной жидкости, равной в наших исследованиях 1,2.

Калибровочные кривые построены на основании изучения степени гемолиза эритроцитов, вызванного смесью стафилококкового токсина с различными

Пример 1, 0,15 мл сыворотки больного Г. разводят в два раза физиологическим раствором и разливают по 0,1 мл в три пробирки, в каждую из которых добавляют по 0,1 мл различных разведений токсина и по О,I мл отмытых эритроцитов кролика. Через

12 мин инкубации при 37 С гемолиз эритроцитов останавливают раствором глютаральдегида. Неразрушенные эритроциты осаждают центрифугированием.

Надосадбчную жидкость переносят в три пробирки, содержащие по 2 ил 0,1 н. раствора соляной кислоты. Осадок в каждой пробирке растворяют в 4 мл

0 1 н. раствора соляной кислоты. Экстинкцию надосадочной жидкости и осадка. измеряют на ФЭКе. Поскольку в первой пробирке гемолиз полный, а в третьей пробирке гемолиза нет, то для дальнейmего анализа используют вторую пробирку (гемолиз частичный). Процент гемолиза эритроцитов в надосадочной жидкости во второй пробирке следующий:

1138126.АЕ .сыворотки

Гемолиз (в надосадочной.жидкости) Токсин

Показания ФЭКа

Визуально

0,27

6,4

Частичный

0,02

Нет 0,1

0 04

0,03

Нет

1,15

1,4

0,4

Полный.

0,33

0,1

Частичный

0,04

0,03

Нет

0,28

1,13

0,4

Полный! э!4

0,1

Полный

Частичный

0,45

0,04

Из таблицы видно, что АЕ сыворотки

6,4„ Как как в пробирках с токсинами0,!LH и 0,04ЬН гемолиза нет, то для определения используется лишь пробир-35 ка с токсином 0,4ЕН, где гемолиз частичный. АЕ сыворотки 1,4. Так как в пробирке с токсином 0,4LH гемолиз полный, а в пробирке с токсином

0,4LH гемолиз отсутствует, то для определения используется лишь пробирка с токсином 0,1LH где гемолиз час-, тичный. АЕ сыворотки 0,28. Так как в пробирках с токсином O 4LH и 0,1LH гемолиз полный9 то для определ ния 45 используется лишь пробирка с токсином 0,04LH где гемолиз частичный.

По известному способу можно получить лишь дискретные значения антитоксической активности сыворотки:

О,!25; 0,25; О 5; 1,0 АЕ (по 1-й схеме) и 2,0; 3,0; 4,0; 6,0; 8,0 и т.д. (по 2-й схеме) По предлагаемому способу возможно пслучение любых непрерывных значений АЕ на всем измеряемом55 диапазоне. Так, например, по известному способу АЕ сывороток (таблица) равнялась бы 6,0; 1,0; 0,25 АЕ, что гемолиэа не даст, что также сделает невозможным определение антитоксической активности.

В таблице даны примеры использования конкретных сывороток и токсинов с определенной LH, является менее точным результатом, по предлагаемому способу соответственно — 6,4; 1,4; 0,28 АЕ.

Предлагаемый способ определения .противостафилококковой антитоксической активности сыворотки крови обьективен, поскольку определяется не только наличие, но и степень гемолиза, и делается это не визуально, а с помощью ФЭКа.

Способ позволяет устранить дискретность получаемых значений антитоксической активности сыворотки крови, что достигается посредством использования калибровочных кривых.

Значительно расширяется диапазон одноэтапно измеряемой антитоксической активности сыворотки, так как по предлагаемому способу можно при одной постановке реакции определить антитоксическую активность сыворотки до

9 АЕ !в. отличие от l АЕ по известному способу

Большое значение имеет значительное, сокращение времени (до 40 мин) осуществления способа, что достигнуто тщательной подборкой соотношений конСоставитель Г. Крюкова

Редактор Л. Гратилло ТехредМ.Надь Корректор И, Эрдейи

Заказ 10583/4 Tmpaa 722 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4

7 1138126 центраций токсина, сыворотки и эрит-роцитов. Постановка метода требует также меньшего количества сыворотки, чем по известному способу. Все это

fn 88мыы

4Р ONE й7 позволяет быстро и точно получить цифровое значение антитоксической активности испытуемой сыворотки крови.