Способ определения активности эстераз в тканях пшеницы

 

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ЭСТЕРАЗ В ТКАНЯХ ПШЕНИЦЫ, включающий взаимодействие субстрата с ферментом и определение продуктов реакции путем фотометрирования, отличающийся тем, что, с целью повышения специфичности определения , в качестве субстрата используют вытяжку из тех детканей пшеницы , предварительно насыщенных смесью фенолкарбоновых кислот npk инкубации на свету, аОпределение ведут ь присутствии ингибитора глюкозидаз. (Л

СОЮЗ СОВЕТСКИХ . СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК

4 (51) G 01 N 33/48

ГОСУДАРСТ8ЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЬПЗФ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н ABTOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВ,Ф (21) 3455643/28-13 (22) 15.06.82 (46) 07.02.85. Бюл. В 5 ,(72) В. В. Чигрин, M. Н. Запрометов, Л. В. Розум и Т. M. Сидоров (71) Северо-Кавказский научно-исследовательский институт фитопатологии (53) 577.15(088 ° 8) (56) 1. Huggins G., Lapides J, Biol. Chem. 1947, 170, 467-482.

2. Аrmstrong et al., J. Biol. Chem

1966, 241, 5137.

3. Ryan С, А. Ann. Rev. Plant

Phys îl, 1973, 24, 173-196.

4 ° Чигрин В. В. и др. Фенолкарбоновые кислоты и лигнин в листьях устойчивых и восприимчивых сортов яровой пшеницы при заражении стеблевой ржавчиной. †",Физиология растений", .973, 20, У 5, 962-968.

„„SU„„11 739 (54) (57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ЭСТЕРАЗ В ТКАНЯХ ПШЕНИЦЫ, включающий взаимодействие субстрата с ферментом и определение продуктов реакции путем фотометрировання, о т— л и ч а ю шийся тем, что, с целью повышения специфичности определения, в качестве субстрата используют вытяжку из тех же тканей пшеницы, предварительно насыщенных смесью фенолкарбоновых кислот при инкубации на свету, а определение ведут ь присутствии ингибитора глюкозидаз.

1138739

Изобретение относится к биохимии, к разделу энзимологии, в частности к способам определения активности эстераз, которые могут найти применение при изучении различных 5 метаболических процессов, связанных с обменом фенилпропаноидных соединений (процессы лигнификации, делигнификации, защитные реакции растений

lIpoTHB экстремальных условий, болезней и т.п.J.

Известен способ определения активности эстераз в различных средах, включающий взаимодействие;.субстрата с ферментом и определение продуктов 15 реакции путем фотометрирования с использованием в качестве ферментного субстрата и-нитрофенилацетата. Фермент инкубируют с и-нитрофенилацетатом в оптимальных условиях и фото- 20 метрируют освободившийся в результате реакции и-нитрофенол E)j

Недостатками этого способа для определения активности эстераз в растительном материале являются не- 25 специфичность и-нитрофенилацетата как субстрата для проявления актив-, ности эстераз, поскольку этот субстрат гидролизуется также карбогидразами (2 1 и протеазами (3, кроме то- 3п го, при гидролизе способа накапливается свободный п-нитрофенол, который обладает заметной токсичностью и при накоплении в реакционной смеси может тормозить или искажать течение ферментного процесса.

Недостатком способа является также невозможность определения активности индивидуальных эстераз.

Целью изобретения является повыше- 40 ние специфичности определения активности эстераз, !

Цель достигается тем, что согласно способу определения активности эстераз в тканях пшеницы, включающему взаимодействие субстрата с ферментом и определение продуктов реакции путем фотометрирования в качестве субстрата испсльзуют вытяжку из тех же тканей пшеницы, предварительно на-5О сыщенных смесью фенолкарбоновых кислот при инкубации на свету, а определение ведут в присутствии ингибитора глюкозидаз.

Для подтверждения специфичности и точности способа используют растения, зараженные ржавчиной (опытный вариант) и незараженные (контроль), roскольку известно, что при заражении

f растений пшеницы ржавчиной происходит резкий гидролиз эфирных фенольных соединений, который осуществляется эстеразами (4 3.

Определение активности эстераз показано в примерах 1 и 2 в присутствии цитоплазматических и связанных с клеточными стенками белков.

Пример 1. Часть листьев пшеницы помещают срезами в 0,01 N фосфатный буфер (рН 6,8), содержащий феруловую, ванилиновую, сиреневую, и-кумаровую и и-оксибензойную кислоты (каждая в концентрации 10 М) . Листья оставляют на 6 ч под лампами дневного света (10 тыс.лк) для заса сывания и метаболизирования поглощенных фенолкарбоновых кислот (ФКК), Целые листья фиксируют кипящим этанолом, измельчают в гомогенизаторе и экстрагируют до обесцвечивания материала горячим 80/-ным этанолом. Экстракт упаривают в вакууме до водного остатка, который очищают от липидов экстракцией петролейным эфиром. Вод-. ный остаток .после подкисления до рН 2,0 экстрагируют диэтиловым эфиром до удаления свободных фенолкарбоновых кислот. Для очистки от низкомолекулярных компонентов и пигментов к водному остатку добавляют смолу

ХАД-2 фирмы "Серва" ФРГ (150 мг/мп), после чего центрифугируют. Очищенный субстракт,содержащий смесь эфирносвязанных фенолкарбоновых кислот, сохраняют на .холоде.

Для определения эстеразной активности из зараженных и незараженных листьев пшеницы выделяют цитоплазматические белки путем гомогенизации листьев в 0,05 М пирофосфатном буфере (рН 9,3) с последующим. высаливанием центрифугата сульфатом аммония при 90 насыщения.

Берут 10 мп раствора белка, 4 мл раствора ингибитора гликозидаз (— лактон глюконовой кислоты) и 4 мл вытяжки. Смесь инкубируют 1 ч при

35 С, реакцию останавливают подкисо лением смеси до рН 2,0. Накопившиеся в результате гидролиза эфиров-.свободные фенолкарбоновйе кислоты извлекают диэтиловым эфиром и проводят их количественное определение с реактивом

Фолияа путем фотометрирования..

Доказательством того, что компоненты субстрата гидролизуются именно

1138739 эстеразами, является полное подавление ферментного гидролиза специфическим ингибитором эстераз — параоксоном (10 М).

Одновременно проводят определение эстеразнои активности с использованием и-нитрофенилацетата в качестве субстрата (1,ббпр 10 М, инкубация

15 мин при 30 C и последующее фотометрирование при 400 нм ). t0

Результаты опыта приведены в .табл. 1.

Таблица 1

Активность эстераз под действием заражения пшениц сорта

Контроль

Опыт Процент 15 .Активность эстераз ролю - под действием заражения пшениц

Конт- Опыт роль

Процент к контролю сорта г

Известный способ, мкг и-нитрофенола/ мг белка ° мин

Известный способ, мкг и-нитрофенола/мг белка/мин

Капли

Баллади 1!б

265 271 102

226 216 96, 25

Предлагаемый способ, мкг ФКК/г сухой массы/мин

Предлагаемый способ, м<г Ф.(К/r сухой массы/мин

Капли

2,82 5,20 184

5@87 7,63 130

Баллади 116

Содержание эфиров в ФКК при заражении, мкг/г сухой массы Капли

Содержание эфиров в ФКК при заражении, 40 мкг/г сухой массы

1526 440 28

li25 997 88

Баллади 116

Как видно из табл. 2, изменения .эстеразной активности белков клеточных стенок аналогичны изменениям при50 мера 1.

Пример 3, Определение активности индивидуальных эстераз.

В отличие от примера 1 пример 3 заключается в том, что освободившиеся.

55 в результате гидролиза фенолкислоты извлекают серным эфиром и разделяют в тонком слое целлюлозы, пропуская в одном направлении 1Х-ную уксусную кисКак видно из данных табл. 1, активность эстеразы, определенная предлагаемым и известным способами, показывает неоднозначные результаты.

При определении известным способом у «онтрольных и зараженных растений эстеразная активность одинаковая (в пределах ошибки ). .В предлагаемом способе активность эстераз у зараженных растений выше, чем в контроле ь на 84,30Х Соответственно возрастающей активности эстераз уменьшается количество эфиров ФКК под действием заражения.

П р:и м е р 2. Определение активности эстераз в белках, выделенных из клеточной стенки растений.

Остатки растительной ткани после экстракции цитоплазматических белков гомогенизируют в 0,1 М фосфатном буфере (рН 6,8) с добавкой 1Х-ного тритона Х-100 и еще три раза тем же буфером без детергента, Остаток растирают в ступе с жидким азотом до получения тонкого порошка, суспендируют в этом . же эфире и используют в качестве источника эстераз, связанных c" клеточной стенкой растений. Результаты определения эстеразной активности приведены в табл. 2.

Таблица 2

Капли 609 56С 92

Баллади 116 1091 924 85

Капли 3,29 4,45 135

Баллади 116 3,73 5,66 152

Капли 1126 548 49

Баллади 116 1279 682 53

1138739 лоту, а во втором — органическую фазу смеси толуол-уксусная кислота— вода 4:1:5. Кроматограммы обрабатывают раствором диазотированного и-нитроанилина, пятна фенолкислот элюируют 5

0,05 н.йаОН в 70Х-ном этаноле и спектрофотометрируют при 253, 280, 290, 340 и 350 нм для сиреневой, п-оксибензойной в и-кумар продолжение талицы

Высвобождение ФКК, мкг/г сырого веса/мин в сортах пшеницы

Капли Баллади 116

Сиреневая

0,58 1,58 анилиновои, феруловои и и-оксибензойовой.кислот соответственно.

Т а б л и ц а 3 ная

0,24 0,73

Таким образом, преимуществами предлагаемого способа определения активности эстераз являются: воэмож15 ность определения активности.фермента в присутствии его природных субстратов, что обеспечивает получение более точных и специфичных сведений об изменении активности по

20 сравнению с существующим методом; возможность определения сравнительной интенсивности гидролиэа эфиров отдельных фенольных соединений.

Высвобождение ФКК, мкг/г сырого веса/мин в сортах пшеницы

Высвобождаемые фенолкарбоновые кислоты

Капли Баллади 116

0,62 1,47

Феруло вая

Ванилиновая 1,28 1,53

n, — êóìàðoâàÿ, 0 10

0,56

Тираж 897 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035 Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Заказ 10680/34

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Составитель И. Привалова

Редактор С. Патрушева Техред М.Надь Корректор О. Билак