Способ колориметрического определения ортофосфата в полиакриламидном геле

 

СПОСОБ КОЛОРИМЕТРИЧЕСКОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОРТОФОСФАТА Б ПОЛИАКРИЛАМРЩНОМ ГЕЛЕ, включающий предварительную обработку геля раствором молибденовой кислоты, отличающийся тем, что, с целью увеличения точности определения, обработку ведут в присутствии красителя метилового зеленого и поверхностно-активного вещества. СП

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТ ИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК (! 9) ((1) (5Ц4 G 01 N 3! /22

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3631828/23-26 (22) 12.08.83 (46) 23.07.85. Бюл. Р 27 (72) С.Е.Волк, А.А.Байков и С.М.Аваева (71) ИГУ им.M.Â.Ëoìîíîñîâà (53) 543.432(088.8) (56) Alexander J.Ê. Purification and

specificity of cellobiose phosphory1азе from Clostridium thermocellum."J. Biol. Chem". 1968, v. 243, № 8, 2899-2904.

Allen J.М., Hyncik G. Localization

of alkaline phosphatase in ge1 matriсев following electrophoresis. J.Histochem. Cytochem. 1963, v. 11, ¹ 2, 169-175.

Klebe R.J., Schloss S., Mock L., 1.1гй С.R. Чiаиа1ization of isozymes

which generate inorganic phosphate,—

"В ochemical Genetics", 1981, v. 19, №- 9/10, 921-927.

Топо Н., Kornberg А. "Biochemical

studies of bacterial sporulation.

Inorganic pyrophosphatase of vegetative cells and spores of Bacillus

subtilis.-"J. Biol. СЬев", 1967, v. 242, ¹- 10, 2375-2382. (54) (57) СПОСОБ КОЛОРИМЕТРИЧЕСКОГО

ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОРТОФОСФАТА В ПОЛИАКРИЛАМИДНОИ ГЕЛЕ, включающий предварительную обработку геля раствором молибденовой кислоты, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью увеличения точности определения, обработку ведут в присутствии красителя метилового зеленого и поверхностно-активного вещества.

1168853

Таблица 1

Количество ортофосфата, нмоль

Площадь .пика, усл.ед.

8,5

Ъ 20

50

67

100

Таблица 2

Количество ортофосфата, еЗ0 нмоль

Площадь пика, усл.ед.

50

35

100

40

Таблица 3

Количество ортофосфата, нмоль

Площадь пика, усл.ед.

10

5,5

100

Изобретение относится к биохимии и аналитической химии и может быть . использовано для количественного определения ортофосфата в полиакриламидном геле. 5

Определение ортофосфата в полиакриламидном геле производится в практике для измерения. активности ферментов, образующих ортофосфат.

Целью изобретения является увеличение точности определения.

Пример 1. Образование ортофосфата в полиакриламидном геле диаметром 0,6 см и длиной 8 см происходит за счет гидролиза. 1 мм пирофос- .15 фата натрия под действием фермента неорганической пирофосфатазы дрожжей, предварительно введенного в полиакриламипный гель электрофорезом в трис-вероналовой системе .рН 7,5. 20

Количество образовавшегося ортофосЬата (р) определяют.по формуле р = 2aet, где а — удельная активность неорганической пирофосфатазы

620 мкмоль/мин на 1 мг белка;

25 е — количество фермента в мг;

t — время инкубации с пирофосфатом натрия в мин. Полиакриламидный гель помещают на 1 ч в проявляющий раствор, содержащий следующие компоненты мас.7.: молибдат аммония 0,85; серная кислота 5; краситель метиловый зеленый 0,013; тритон Х«100 О, 125; вода остальное. Затем полиакриламидные гели промывают водой и денситометрируют при 620 нм. На денсито.— граммах измеряют площади пиков. Результаты измерений площади пиков по примеру 1 приведены в табл. 1.

Средняя ошибка определения составляет 2 усл.ед..

Пример 2. Пример осуществляют аналогично примеру 1, но в качестве поверхностно-активного вещества берут Бридж-35.

Результаты измерений по примеру 2 приведены в табл. 2.

Пример 3. Пример осуществляют аналогично примеру 1, но в . качестве поверхностно-активного вещества берут лаурилсульфат лития.

Перед денситометрированием гели вымачивают 6 ч в воде для снижения фоновой окраски. Результаты измерений по примеру 3 приведены в табл. 3.

Технико-экономическая эффективность способа заключается в повышении точности, высокой чувствительноствю и простотой определения.