Способ определения холинсодержащих фосфолипидов

Авторы патента:

G01N33/52 - использование соединений или составов для колориметрического, спектрофотометрического или флуорометрического анализа, например реактивной бумаги

G01N33/48 - биологических материалов, например крови, мочи (G01N 33/02-G01N 33/14,G01N 33/26,G01N 33/44,G01N 33/46 имеют преимущество; определение всхожести семян A01C 1/02); приборы для подсчета и измерения клеток крови (гемоцитометры) (подсчет клеток крови, распределенных по поверхности, путем сканирования этой поверхности G06M 11/02)

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ХОЛИНСОДЕРЖАЩИХ ФОСФОЛИПИДОВ путем обработки раствора фосфолипидов реагентом , образую11№1м окрошенный комплекс с фосфолипидами, с последующим измерением интенсивности поглощения окрашенного комплекса в органической фазе, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности и точности определения фосфолипиды растворяют в четырехклористом углероде, а в качестве реагента используют реактив драгендорфа при объемном соотношении реагента и раствора фосфолипидов не менее 4:5.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК (l9} (kl} (Sl}4 G 01 N 33/48, 33/52

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3632574/28-13 (22) 04.08.83 (46) 23.07.85. Бюл. Ф 27 (72) И.В. Гордезиани, H.À. Царцидзе, Б.А.Ломсадзе и Н.А. Куциава (71) Тбилисский ордена Трудового

Красного Знамени государственный университет (53) 547.953(088.8) (54)(57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ХОЛИНСОДЕРЖАЩИХ ФОСФОЛИПИДОВ путем обработки раствора фосфолипидов реагентом, образующим окрошенный комплекс с фосфолипидами, с последующим измерением интенсивности поглощения окрашенного комплекса в органической фазе, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности и точности определения фосфолипиды растворяют в четыреххлористом углероде, а в качестве реагента используют реактив драгендорфа при объемном соотношении реагента и раствора фосфолипидов не менее . 4:5.

1168862

Составитель Г. Белоусов

Техред О.Ващишина

Редактор А. !!1андор

Корректор Е. Сирохман

Подписное

Заказ 4609/38 Тираж 897

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4.

Изобретение относится к биохимии, химии и физико-химической биологии и может быть использовано при биохимическом анализе фосфолипидов в растворах крови, органах и органел- 5 лах.животных.

Целью изобретение является повышение чувствительности и точности определения. !

Пример. К 5 мг лизосом печени крыс прибавляют 10 мп смеси хлороформметанол 2:1, два раза смесью

1:! по 5 мл и затем осадок заливают этой же смесью 1: 1 (5 мл) и оставляI . ют на ночь. На следующий день экстракция липидов проводится еще дважды по 5 мл смесью хлороформ-метанола 2:1.

Объединенные липидные экстракты 20 отмывают от водорастворимых примесей охлажденным раствором 15 мл

О,ЗМ NaC1 (раствор добавляется с таким расчетом, чтобы верхний водный слой содержал не более 50Х спирта, чтобы 5 он не извлекал фосфолипиды) . После центрифугирования верхний водорастворимый слой отсасывается. Пленка, образующаяся на поверхности раздела двух фаз (хлороформенный и водно-спирто- 30 вой) растворяется добавлением небольшого количества этилового спирта.

Хлороформенный экстракт, содержащий фосфолипиды, упаривают досуха, под вакуумом,при комнатной температуре.

Общее количество липида определяют весовым методом: определено 2,75 мг общей фракции липидов, Липиды растворяют в 50 мп ССТ< (55 мкг/мл).

Процесс выделения липидов и опре- 40 деления в них количества холинсодержащих фосфолипидов (фосфатидилхолин, сфингомиелин) проводят при стандартных условиях (комнатная температура

18 вЂ” 20 С, давление 760 мм рт.ст.), К 5 мл липидов (55 мкг/мл) прибавляют 5 мл реактива Драгендорфа °

Для его приготовления 1,7 r нитрата висмута растворяют в 100 мл 20 . уксусной кислоты (! раствор), à IO r иодида калия в 25 мл дистиллированной воды (I! раствор) и перед опытом 20 мл раствора I смешивают с

5 мл раствором !I и разбавляют 70 мл воды.

После смешивания и встряхивания липидного раствора с реактивом Драгендорфа водную и органическую фазы разделяют и измеряют интенсивность поглощения, перешедшего в органическую фазу (СС V4) реактива при длине волны 500 нм и определяют количество холинсодержащих фосфолипидов по стандартной кривой, которая построена по известным концентрациям фосфотидилхолина. Количество холинсодержащих фосфолипидов в 1 мл CC f4 составляет 22 мкг.

На выделенные из лизосом 2,75 мг липидов приходится (22 мкг х 50 мл)=

1, 1 мг холинсодержащих фосфолипи;. дов. На 1 мг общей фракции липида лизосом приходится 400 мкг, а на

1 мг лизосом (1, 1 мг: 5 мг) =220 мкг холинс одержащих фосфолипидов.

Предлагаемый способ более точно определяет заданное количество фосфолипида. Ошибка опыта в известном способе составляет 4,9, а в предлагаемом - 3 3 . С помощью известного способа невозможно определить количество холинсодержащих фосфолипидов ниже 30 мкг, а предлагаемым способом можно определить 8 мкг холинсодержащего фосфолипида.