Способ определения повышенной чувствительности организма к дрожжеподобным грибам

 

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОВЫШЕН-. НОЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ОРГАНИЗЙА. К : ДРОМЕПОДОБНЫМ ГРИБАМ путем исследования крови, оо-личающийс я тем, что, с целью повышения точности способа из исследуемой крови вьщеляют лейкоциты и инкубируют их с эритроцитами барана, сенсибилизированными Candida gniliiermondii в течение 30-35 мин при 36-37% при этом антиген для сенсибилизации эритроцитов добавляют в дозе 0,54 мг/мл. S

СОЮЗ СО6ЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (! 9) (11): (Sl)4 А 61 К 39/00

ГОСУДАРСТ1 ЕННБiй HOMHTET CCCP

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЦТИЙ

>c". . и ф

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ASTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 3499938/28-13

:.(22) 12.10.82 (46) 15.09.85. Бюл. М 34 (72) А.В.Литовская (71) .Горьковский научно-исследовательский институт гигиены труда и профзабблеваний (53) 615.375 (088.8) (56) Елинов И.П. Патогенные дрожжеподобные организмы. М, Медицина, 1964 286-312. (54) (57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПОВЫШЕН-, НОЙ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ СРГАНИЗИА К

ДРОИЖЕПОДОБНЫМ ГРИВАМ путем исследования крови, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения точности способа из исследуемой крови выделяют лейкоциты и инкубируют их с эритроцитами барана, сенсибилизированными Candida gniiliermondii в течение 30-35 мин при 36-37 С при этом антиген для сенсибилизации эритроцитов добавляют в дозе 0,54 мг/мп.

1178451

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и может быть использовано для диагностики повышенной чувствительности к антигенам, в частности к дрожжеподобным грибам рода Кандида.

Целью изобретения является повышение точности способа, Пример. Производят формалинизацию эритроцитов барана. Кровь отбирают в раствор Олсвера в отношении 1:1 и выдерживают при 4 С в течение 24 ч. Затем трижды отмывают

20 объемами забуференнаго физиологического раствора (ЗФР) рН 7,2 в течение 20 мин при 4 С и 1500 об/мин

Из осадка готовят 8%-ную суспензию эритроцитов на ЗФР рН 7,2, к которой добавляют равный объем 3%-ного раствора формалина на ЗФР рН 7,2.

Смесь переливают в плоскодонную колбу и ставят на магнитную мешалку на 18 ч при 37 С, после чего отмыо вают 6 раз 20 объемами ЗФР рН 7,2.

Присутствие формалина контролируется реактивом Ыиффа. Из осадка готовят

10Х-ную взвесь эритроцитов на

ЗФР рН 7,2, которая может хранитьО ся при 4 С в течение 4-5 мес.

Подбор оптимальной дозы антиге- ЗО на для нагрузки эритроцитов проводят в серии предварительных опытов, за-. ключающихся в инкубации формалинизированных эритроцитов с различными концентрациями кандидозного антигена. В ряд пробирок вносят по 1 мл раствора, состоящего из возрастающих количеств сухого антигена (0,5; 1; 2; 3", 4 мг) в ЗФР рН 6,4, и добавляют 0 1 мл предварительно 40 отмытых 50%-ных формалинизированных эритроцитов барана. Смесь инкубируют

30 мин при 37 С на водяной бане при периодическом встряхивании, быстро отмывают 2 раза при 4 С и 1500 об/мин45 от несвязавшегося антигена ЗФР рН 6,4 с добавлением нормальной инактивированной кроличьей сыворотки в разведении 1:100. Готовят 1%-ную взвесь эритроцитов в ЗФР рН 7,2. Про" 50 водят реакцию непрямой гемагглютинации (РНГЛ) с сывороткой кролика, иммунизированного данным кандидозным антигеном по общепринятой методике, и устанавливают оптимальную дозу 55 кандидозного антигена, равную 1 мг.

Приготовленная 1%-ная взвесь формалинизированных эритроцитов барана, сенсибилизированных кандидозным антигеном в концентрации 1 мг/мл, может храниться при 4 С в течение

4-5 мес при неизменной активности, что было установлено опытным путем.

У обследуемого иэ вены отбирают

3 мл крови в гепарин (из расчета

25 ед. на 1 мл крови), добавляют

3 мл среды 199, осторожно наслаивают на градиент плотности фиколл-верографин (d = 1,077) и центрифугируют

30 мин при 400 . Образовавшееся на границе среды и градиента плотности кольцо лимфоцитов отсасывают пастеровской пипеткой, суспензию клеток отмывают 2 раза средой 199 в течение 10 мин при 1000 об/мин. К осадку добавляют 1 мл среды 199, осторож. но ресуспензируют и подсчитывают количество выделенных лимфоцитов в камере Горяева при окраске генцианвиолетом.(0,05%-ный раствор на 3%-ном растворе уксусной кислоты) общепринятым методом. Доводят концентрацию лимфоцитов до 2 л 10 в 1 мл среб дой 199.

К 0,1 мл суспензии лимфоцитов добавляют 0 1 мл приготовленных сенсибилизированных эритроцитов, инкубируют 30-35 мин при 36-37 С, затем осаждают центрифугированием в течение

5 мин при 1000 об/мин. Фиксируют образовавшиеся "розетки" 0,05 мл 0,06%ного раствора глютаральдегида в течение 20 мин при комнатной температуре, Для прерывания фиксации приливают 1 мл дистиллированной воды, центрифугируют 5 мин при 1000 об/мин.

Осадок острожно ресуспензируют, на обезжиренном стекле пастеровской пипеткой приготавливают препараты, которые окрашивают по ПаппенгеймуКрюкову. Микроскопию проводят с иммерсией, просчитывают 200 лимфоцитов, среди которых определяют процент клеток, присоединивших три и более эритроцита. Абсолютное количество POK в 1 мкл крови определяют, исходя из количества лейкоцитов и числа лимфоцитов, найденных при подсчете лейкоцитарной формулы.

Контроль ставят с 1%-ной взвесью формалинизированных эритроцитов барана без антигена. Реакцию считают положительной при наличии 20Х и более РОК.

Способ апробирован при обследовании 298 человек, имеющих контакт

Составитель Г.Крюкова

Техред:Т.Фанта Корректор А.Зимокосов

Редактор М.Митейко

Заказ 5582/6 Тираж 722 I.îäïHñ но е

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4

3 1 с дрожжеподобными грибами рода Кандида в условиях производства. Контрольную группу составили 53 практически здоровых человека, не имеющих контакта с указанными грибами.

У лиц контрольной группы содержание POK составило 12,210,6Х. При нимая за норму колебание показателя в пределах М11,5Я, реакцию считают положительной при наличии 20Х и более POK. В контрольной группе положительный результат обнаружен в 9,4Х лиц. Достаточно высокое содержание POK и частота повышенной чувствительности к грибам рода Кандида у лиц контрольной группы связаны по-видимому, с широким распространением указанных грибов в природе и наличием общих антигенных детерминант у представителей разных видов.

Повышенная чувствительность к кандидозному антигену обнаружена у 28,8Х обследованных, контактирующнх с дрожжеподобными грибами. Pas178451 4 личия между Группами установлены и при сравнении средних величин количества POK как в относительных, так и в абсолютных показателях.

Полученные данные свидетельствуют о, наличии специфической сенсибилизации у лиц, имеющих производственный контакт с грибами рода Кандида, которая в 3 раза превышает

1р уровень таковой у лиц контрольной группы, что позволяет судить о чувствительности и специфичности метода выявления клеточной гиперчувствительности.

Проведено сравнение предлагаемого способа диагностики клеточной гиперчувствительности in vitro с тестами, выявляющими гуморальную гиперчувствительность к дрожжеподобным грибам О рода Кандида у контактирующих с ними. Положительная реакция розеткообразования обнаружена не только у лиц с положительными, но и у лиц с отрицательными гуморальными теста25 MH °