Способ получения содержащего фруктозу продукта из сахарозы

 

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (50 4 С 07 11 3/02

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н ПАТЕНТУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 2626705/23-04 (22) 15.06.78 (31) 807289 (32) 16.06.77 (33) US (46) 07.05.86. Бюл. Р 17 (71) СПС Интернэшил, Инк (US) (72) Роберт Е. Хеди (US) .(53) 547.455.07(088.8) (56) Kerk — Qthmer. Encyclopedia of

chemical technology third edition, v. 4, N.Л 1973, с. 543-544. Handbo

ok of Sugars, second Edilion Profuerties of Invert and sucrose-Invert

Solutions. P,. 81-83, 1976. (54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СОДЕРЖАШЕГО ФРУКТОЗУ ПРОДУКТА ИЗ САХАРОЗЫ, включающий обработку сахарозы ферментом при температуре 58 С и рН 5,5

„„SU „„1230469 с получением смеси, содержащей декстрозу и фруктозу, о т л и ч а ю— ш и и с я тем, что, с целью повышения содержания фруктозы в целевом продукте, сахарозу обрабатывают фруктозилтрансферазным ферментом dnulosucrase 2.4.1.9 с получением продукта, содержащего декстрозу, фруктозу и полисахариды, содержащие не менее

66 мас.7 фруктозильных остатков, причем фруктозильные остатки связаны (2 1) P -связью с последующей последовательной обработкой изомеразным ферментом, иммобилизованным на о. пористой окиси алюминия, при 60 С и рН 8,4 и инвертазным ферментом в течение 2-6 сут или кислотой, такой как соляная или серная, в течение 1ч и в отсутствие активного изомеразного фермента.

1230469

Посевные колбы (500-миллилитроI вые колбы Эрлемейера, содержащие

100 мл стерильной среды указанного 35 состава) засевают исходной культурой черных дрожжей pullularia pullulans„ на скошенном агаре. Для этой цели используют штаммы этих дрожжей, который обозначен в каталоге под назва- 40 нием "Коллекция типовых культур США" (Роквилл, Мэриленд, American Type

Cneture co11.ection) как штамм

ATCC 9348. Эти посевные колбы (после выдерживания Нх на качалке возвратно- 45 поступательного типа в течение 48 ч г|ри 32 С) ис||ольэуют для инокуляции

1-литровых эрленмейеровских ферментационных колб, каждая из которых содержит 200 мл среды указанного сос- щ тана. При этом .используют концентраци|о посевного материала (инокулята), равную 0,5% (масса/объем). Ферментацию проводят на качалке возвратнопос.упательного типа в течение 7 дн. 55 (Ъ при 32 (,, И влечение фермента из ферментаци О н н О Г О б г |! е о н а .

Изобретение относится к способу получения продукта, содержащего фруктоэу из сахарозы, который находит применение в пищевой и фармацевтической промышленности.

Цель изобретения — повышение содержания фруктозы в целевом продукте.

Предлагаемый способ обеспечивает получение фруктовых сиропов, содержащих более 55% фруктозы.

Приготовление 1 является иллюстрацией типичной процедуры ферментации, проводимой с целью получения желаемого фермента из штамма дрожжей

pu11ц1агга pul1u1ans АТСС 9348.

Получение ферментного препарата фруктоэилтрансферразы на целитном носителе ° Процедура ферментации, используемая для продуцирования укаэанного фермента.

Среда, используемая для развития посевной культуры (инокулята) и для ферментации с целью продуцирования желае||ого фермента, имеет следующий состав,%. "дигидрофосфат калия 0,5; хлористый натрий 0,1; гептагидрат серно-кислого магния 0,02; сульфат аммония 0,06; дрожжевой экстракт (производства фирмы | Дифко Лабораториз ) 0,3> сахароза (пищевого сорта) 7,5. рН среды доводят до 6,8.

Ферментационные бульоны иэ сорока

1-литровых встряхиваемых на качалке колб объединяют вместе, освободившиеся колбы ополаскивают водой и эти промывные воды тоже присоединяют к объединенному ферментационному бульону. Конечный объем бульона после разбавления составляет 12 л. Первоначальный объем ферментационного бульона равен приблизительно 8 л. 12 л ферментационного бульона пропускают через непрерывную центрифугу типа

"шарплес" с целью удаления дрожжевых клеток и клеточных остатков. К полученному супернатанту, который представляет собой черный вязкий раствор, прибавляют затем хлористый кальций до концентрации 0,5% (масса/ объем) и рН полученного раствора доводят до 7,0 с помощью гидроокиси натрия, Затем эту систему вторично пропускают через центрифугу типа шарплес", получая в итоге вязкий супернатант, имеющий незначительную по интенсивности окраску. Величину рН этого обесцвеченного супернатанта до:водят соляной кислотой до 5,5 и затем вносят 1000 ед. пуллюланазы.

Получаемый при этом бульон консервируют с помощью толуола (добавляемого до насыщения) и пуллюланазу оставляют реагировать при температуре окружающей среды на ночь. После ферментолиза пулл1||ланазой в течение ночи в бульоне суспендируют 1% (т.е. достаточное для образования суспензии

1%-ной концентрации) целита "Графко

Ф 503, Gretco Р 503 Celite" производства фирмы "Дзонс Манвилл Продактс

Корпорейшн", Ломпок, Калифорния и затем добавляют туда же 2 объема (24 л) ацетона. При этом образуется осадок, который собирают фильтрованием, фильтр-прессную лепешку промь|вают на фильтре ацетоном и сушат при температуре окружающей среды. Собранный на фильтре осадок (фильтр-прессиая лепешка) содержитпереведенный в нераст-l, воримое состояние (иммобилизованный) фермент фруктоэилтрансферразу.

В приготовлении 1 следует обратить внимание на то, что прибавление хлористого кальция к ферментационному бульону и доведение рН бульона до

7,0 приводит к удалению черного пигмента и присутствующих в бульоне кислых полисахаридов.

1230чб9

Благодаря указанной обработке целевой ферментный продукт получается в виде сравнительно чистого бесцветного препарата. С помощью этого метода обеспечивают целевой ферментный препарат, не содержащий нежелательный пигмент и кислые полисахариды, которые образуются в качестве побочных продуктов в процессе ферментации и, если их не удалить своевременно, со- 10 осаждаются с ферментом при добавлении к ферментационному бульону растворителя (ацетона).

В качестве дополнительной меры очистки при выделении очищенных фер- 15 ментных препаратов желательно удалить из ферментационного бульона пуллюлановый полисахарид, неизбежно присутствуюший в нем, вследствие того что этот полисахарид тоже будет 20 соосаждаться с ферментом фруктозилтрансферразой при добавлении растворителя к ферментационному бульону.

Поэтому супернатант, полученный в результате обработки ферментационного 25 бульона хлористым кальцием и доведения рН до 7,0 гидроокисью натрия, может быть подвергнут дополнительной обработке известным гидролизующим ферментом пуллюланазой. Фермент пул- 3р люланаза беспоряцочно гидролизует пуллюлан с образованием низкомолекулярного полимера, что позволяет избежать соосаждения и, как следствие этого, загрязнения ферментного пре35 парата фруктозилтрансферразы в процессе обработки бульона органическим растворителем (например, ацетоном, этиловым спиртом и т.д.).

Фруктозилтрансферразные ферментные препараты могут быть использованы и без удаления пуллюлана.

Э к с и е р и м е н т 1. Получение вторичного субстрата при исполь-. зовании фермента фруктозилтрансферразы на пуллюлановом носителе.

К 207.-ному раствору сахарозы, забуференному 0,05 M цитратным буфером с рН 5,5 прибавляют 1 мас.7. сухого пуллюлана, полученного в соответствии с методикой приготовления 1 с той разницей, что пуллюлан не гидролизуют пуллюланазой, а оставляют в системе качестве носителя фермента фруктозилтрансферразы. По этой причине 55 не используют целит, который вносят в бульон после его обработки пуллюланазой в качестве носителя в примере 1 . Активность ферментного препарата фруктозилтрансферразы, полученного в соответствии с такой видоизмененной методикой, составляет 677 ед на I г пуллюлана. Реакцию проводят при температуре окружающей среды до тех пор, пока смесь не помутнеет.

Образец этого материала анализируют с помощью жидкостной хроматографии высокого давления и получают в итоге следующие результаты.

Углеводный (сахаридный) состав смеси, вычисленный по результатам анализа методом жидкостной хроматографии высокого давления,X: фруктоза 6,9; декстроза 40,6; ДР 6,2;

ДР) li,i; ДР 35 2.

ДР означает степень полимеризации полисахарида.

Эксперимент 2 дополнительно характеризует фермент. полученный согласно приготовлению !.

Э к с п е р и м е н т 2. Эксперимент i относится с трансфруктозилазации с использованием первичного субстрата, в котором содержание сухого вещества исходной сахарозы не превышает точку насыщения при данных условиях реакции. Эксперимент 2 показывает использование первичного субстрата с начальной концентрацией сахарозы выше насьлцения, который под воздействием фермента фруктозилтрансферразы дает продукт, содержащий повышенные уровни материала ДР (т.е. фруктозилсахарозы) и пониженную концентрацию продуктов ДР„ . Кроме того, показано увеличение койцентрации сухого вещества (B мас. отношении).вторичного субстрата по сравнению с концентрацией сухого вещества, полученного при отсутствии ферментов фруктозилтрансферразы. Кроме того, показано, что с понижением концентрации сухого вещества полимера фруктозы во вторичном субстрате материал ДР„, присутствует в незначительных количествах. Это отличается от результатов эксперимента 1 с исполь зованием субстратов сахарозы на уровне ниже точки насыщения.. В этих примерах ДР, является первичным продуктом.

Приготовление вторичного субстрата из шламов сахарозы выше точки насыщенияя, Пищевую сахарозу в виде 200 г аликвот помещают в 1-пинтовые склян230469

Т а б л и ц а 1!

Фермент—

Сухое вещество

СахаС1 лянка роза, г в надо-, ные садочной еди— ницы

ДР, ДР

Фрук- Дек- ДР„ жидкости, массовое соотношение строза (! гоза! !

1 ! т н.о.

62,6

0,9

15,7

19,0 1,8

1 7,3

58,5 21,0 2,1

1„3

56,0

18 0

2! 9 2,8

18,8

53 8

23,1

52„2

19,3

24,1

3,4

?00 900 79,0

19,9

50,0

25,0 3,7

?5,4 4,1

200 1000 79,6

48,6

20,6

Не Об

Не об- Не об99,7 наружено наружено нару жено

$ 1 ки с завинчивающейся пробкой. В качестве контроля в одну склянку добавляют 50 мл воды, а в другие

50 мл воды, содержащей увеличивающиеся количества фермента фруктозилтрансферразы — препарат "Селит" (получен согласно приготовлению 1).

Каждую склянку закрывают пробкой и помещают во встряхиваемую водяную ванну при 54-55 С. Склянки встряхивают в течение 24 ч при периодическом ручном перемешивании. Образец

200 100 74,5

200 200 75,6

200 300 76,3

200 400 77,1

200 500 77,7

200 6>00 78,1

200 700 78,1

200 800 80,!

Контроль 200 Нет 72,7

Хотя в вксперименте ? использовалось 200 г сахарозы на .50 мл воды т.е. 80 мас,X-ное соотношение, концентрация сухого вещества исходного вещества сахарозы может быть увеличена.

В примерах 1 и 2 при изомеризации ,декстрозы во фруктозу используют имнадосадочной жидкости удаляют из каждой склянки и помещают в испытательной колбе с завинчивающейся пробкой в ванну с кипящей вацой для инактивапии фермента. Затем зти образцы анализируют с помощью жидкостной хроматографии высокого давления и определяют сухое вещество в надо— садочной жидкости (способ Фишера).

Результаты исследований представлены в табл. 1, Состав карбогидратов в растворе при использовании жидкостной хроматогра— фии высокого давления, 7

06 96 809 89

0,7 12,7 72,? 13,7 0,7

1,0 14,5 66,,8 16,6 1,1 мобилизованную глюкозоизомеразу, которую иммобилизуют по следующей методике.

Носитель из пористой окиси алюминия дважды промывают водой и при перемешивании инкубируют в течение 1 ч с О,", М цитратом натрия, который вымывают иэ носителя до тех пор, 1230469

Т а б л и ц а 2

Анализ состава, вес.Х, после обработки

Углеводы

dnulosu:êñèëîçîcrase изомера2.4.1.9 зой

5.3.1.5 инвертазой дополнительно в в течение нотечение

6 дн. чи

62,4

Фруктоза 2,4

Лекстроза 32,8

41,9

15,7

29,4 36,2

18,9

1,9

10,6

11,0

0, 5

1 2, 9

22,9

22,9

ДР

0,9

13,9

32,5

31,3

Г1Р

g+ пока проводимость промывных вод не достигнет 1000 мкОм . Носитель инкубируют с 0,05 M хлоридом магния в течение 1 ч, после чего раствор хлорида магния декантируют.

Добавляют такой объем 0,05 M хлорида. магния, чтобы получить результирующую концентрацию фермента, равную

400 ед./мл, Концентрат глюкозоиэомеразы (ксилозоизомераза 5.3.1.5), полученный с помощью Streptomices

olivochromogenes ATC 21715, прибавляют к носителю в концентрации

14 мл. ед. на 1 ф (около 28,4х10 CMЗ).

Носитель и фермент выдерживают в контакте 22-24 ч, после чего несвязавшийся фермент отмывают с носителя дистиллированной водой.

Полученный таким образом иммобилизованный фермент загружают в стеклянную колонку с рубашкой (Зх18 см), снабженную насосом, соединенным с подающим питающим резервуаром. Основной объем колонки после загрузки равен 45 мл .

Пример ). Сахарозу пищевой чистоты (600 r) растворяют в воде до общего объема 800 мл, рН этого раствора доводят до 5,5 с помощью разбавленной хлористоводородной кислоты. Сухую рецептуру цеолитфермент (dnulosucrase 2.4.1.9), ll r, имеющую активность 550 ед/г и полученную согласно эксперименту 1, суспендируют в 100 мл воды. Суспензию отфильтровывают под вакуумом на воронке

Бюхнера с использованием фильтра иэ бумаги ватман ¹ 1. Осадок на фильтре дополнительно промывают 100 мл воды.

После этого 200 мл фильтрата прибавляют к раствору сахарозы, который помещают в сосуд емкостью 1,89 л, снабженный завинчивающейся крышкой.

10 Затем сосуд помешают в водяную баню с температурой 58 С и проводят реакцию в течение 20 ч. Реакционный продукт содержит смесь декстрозы, фруктозы и полисахаридов, содержащих не менее

15 чем 66 мас.X фруктозильных остатков, причем фруктозильные остатки связаны (2 — -1) -связью.

Состав углеводов следующий,7: фруктоза 2,4, декстроза 32,8;

20 ДР 10,6; ДР 22,9; ДР„ 31,3.

После этого к продукту реакции прибавляют хлорид магния концентрацией 5 ммоль/л и рН доводят до 8,4 добавлением разбавленного раствора гидроокиси натрия. Затем эту смесь подвергают действию глюкозоизомеразы (ксилозоизомераза 5.3.1.5), иммобилизованной на пористой окиси алюминия в колонке (иммобилизованную изо30 меразу получают по указанной методике) нри 60 С и рН 8,4. Определяют углеводный" состав продукта, собранного из колонки.

Данные представлены в табл. 2.

1230469

Анализ состава, мас.7.

Углеводы после обработки

dnu1.îsucпосле обработки после реакции с серной кислотой ксилозизомеразой

5.3,1,5 через

2 ч проведения

rase

2.4.1.9 через

1 ч про— ведения реакции реакции

Фруктоза

2,4

15,7

60,3 59,1

32,8

Лекстроза

18,9

38,7

37,9

10,6

11,0

1,9

2,6

22,9

22,9

0„4

0,3

31,3

31,5

0,2

После этого продукт подвергают действию очищенного инвертазного фермента, полученного из Candida

uti1is при соотношении 10 мг фермента на 100 мл продукта, и проводят реакцию в течение ночи при комнатной температуре. Образец продукта анализируют с помощью жидкостной хроматографии высокого давления, а с оставшимся продуктом проводят реакцию еще 10 в течение 6 дн. после анализа. Конечный продукт содержит 62,4Х фруктозы, в то время как обычная инверсия сахарозы обработкой инвертазным ферментом дает продукт, содержащий 15

50% фруктозы.

Пример 2. Сахарозу пищевой чистоты (600 г) растворяют в воде с получением общего объема 800 мл,,Q рН этого раствора доводят до 5„5 с помощью разбавленной хлористоводородной кислоты. Сухую рецептуру цеолитфермент (йтш1.osucrase 2.4.1.9),. 11 г, 1 имеющую активность 550. ед/г и полученную по эксперименту 1, суспендируют в 100 мл воды. Суспензию отфильтровывают под вакуумом на воронке Бюхнера с использованием фильтра из бумаги ватман 11 - 1. Осадок на 30 фильтре дополнительно промывают в

100 мл водь|. После этого 200 мл фильтрата прибавляют к раствору сахарозы, находящемуся в сосуде емкостью

1,89 л с завинчивэющейся крышкой. За-g тем сосуд помешают в водяную баню с температурой 58 С и проводят реакцию в течение 20 ч. Продукт реакпии содержит смесь декстрозы, фруктозы и полисаха.ридов, содержаших по крайней мере 66 мас.7. фруктозильных остатков, причем фруктозильные остатки связаны (2-- 1) P -связями. Определяют состав реакционного продукта.

Затем в реакционный продукт прибавляют хлорид магния в концентрации

5 ммоль/л, рН доводят до 8,4 добавлением разбавленного раствора гидроокиси натрия. Затем эту смесь подвергают действию глюкозоизомеразы (ксилозоизомераза 5.8.1.5), иммобилизованной на пористой окиси алюминия в колонке (иммобилизованную изомеразу получают по указанной метоцике) при температуре 60 С и рН 3,4, Определяют углеводный состав продукта,, собранного из колонки, К этому процукту прибавляют серную кислоту концентрацией 0,05 н, Смесь нагревают до 75-80 С и проводят реакцию в течение 2 ч. Через !-? ч про1 ведения реакции отбирают образцы и прово ят их анализ на углеводный состав с помощью жидкостной хроматографии высокого давления. Результи. рующий продукт содержит приблизитель. но 60 7 фруктозы. Обычйая инверсия сахарозы обработкой инвертазным фер— ментом дает продукт, соцержащий 507 фруктозы.

Результаты исследований представлены в табл. 3, Т а б,л и ц а 3

230469

Составитель Г. Коннова

Техред Л. Сердюкова Корректор; И. Эрдейи

Редактор А. Коэориэ

Заказ 2463/60 Тираж 343 Подписное

В1!ИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, -35, Раушская наб., д. 4/5

С.Производственно-полиграфическое предприятие, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

11 1

Пример 3. Продукт, полученный после обработки ксилозоизомеразой 5.3.1.5 по примеру 1, подвергают гидролизу инвертазой полученной из Pfansteihl. Laboratories, Waukegan, Illifnois) с использованием

0,1 мл инвертазы Hà 10 мл раствора.

Гидролиз для фруктозы и глюкозы завершают через 48 ч. р и м e p 4 ° Продукт, полученный после обработки ксилоэоизомеразой 5.3.1.5 по примеру 2, подвергают гидролизу разбавленной соляной кислотой при 70 — 80 С. Гидролиз для фруктозы и глюкозы завершают приблизительно через ,1 ч.