Способ разделения нуклеиновых кислот

 

Изобретение относится к анайитической химии, в частности к анализу нуклеиновых кислот методом тонкослойной хроматографии и может 5ыть использовано при идентификации этих кислот и сопутствующих им компонентов . Цель - упрощение и повьшение селективности способа. Анализ проводят на аминопропйлировайном силикагеле, используя в качестве подвижной фазы смесь 0,9-1,1 М водного раствора уксусной кислоты и этанола при соотношении компонентов 10:1. Применение 2М СИ СООН в составе подвижной фазы разрушает люминофор, и фон пластинки темнеет. Указанные условия обеспечивают хорошее разделение смеси рибонуклеотидов или дезоксинуклеотйдов, т.е. RJ имеют разные значения, в то время как в известном способе значения R j для разных компонентов совпадают, и поэтому разделение не достигается. 4 табл. .с € (Л С

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (Я) 4 G О! N 30/94

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

Il0 ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3813972/23-04 (22) 27,09.84 (46) 23.06.86. Бюл.9 23 .(71) Научно"исследовательский конструкторско-технологический институт биологически активных веществ (72) С;Ф. Карпова, В.И. Пупкова и Ю.Л. Хрипин (53) 543.54.42(088.8) (56) Okamoto М, Uamada F. The Effect оУ Methylene Chain length on the Chromatographic Behaviour of Aminobonded si1icas in High-Performance ТЬ1п Layer

Chromatography,-Chromatographia, 1982, v.!6, р.152-154;

Jont !!., Hauck Н.Е. А Modified

High Performance Thin Layer plates

e er the Separation of Purines and

РугйвЫхпез-Апа1 Bioclem., 1983, ч.135, У 1, р.!20-127. (54) СПОСОБ РАЗДЕЛЕНИЯ НУКЛЕИНОВЫХ

КИСЮТ

„„SU„„1239588 А 1 (57) Изобретение относится к аналитической химии, в частности к анализу нуклеиновых кислот методом тонкослойной хроматографии и может быть ис I пользовано при идентификации этих кислот и сопутствующих им компонентов . Цель - упрощение и повышение селективности способа. Анализ проводят на аминопропилированном силикагеле, используя в качестве подвижной фазы смесь 0,9-1,1 И водного раствора уксусной кислоты и этанола лри соотношении компонентов 10:1. Применение

2М СН СООН в составе подвижной фазы разруйает люминофор, и фон пластинки .О темнеет. Указанные условия обеспечи- - Е вают хорошее разделение смеси рибонуклеотидов или дезоксинуклеотидов, т,е. К имеют разные значения, в то время как в известном способе значения Й для разных ком- Я понентов совпадают, и поэтому разделение не достигается. 4 табл.

Таблица 1

Величины R в системах с различной концентрацйей уксусной кислоты

Разделяемые компоненты

) 1 Т I

0,73

9 72 0,72

Аденозин

0,72

0,73

0,75

Аденоэин-5монофосфат

0,04 О, 10

0,19 0,21

0,20

0,21

Уридин-5— монофосфат

0

4 12

Изобретение относится к аналитической химии, в частности к методу тонкослойной хроматографии, и может использоваться в аналитических исследовательских лабораториях при анализе нуклеиновых кислот °

Целью изобретения является упрощение способа .и повышение его селективности, Разделение анализируемой. пробы осуществляют на пластине "Силуфол

УФ-254", пластину погружают в 1,02,07."ный раствор аминоцропилтриэтоксисилана в .этиловом спирте, выдерживают 50-60 мин, после. чего вынимают, подсушивают 20-30 мин на воздухе и промывают 1 раз этиловым спиртом, На аминопропилированную пластину наносят раствор анализируемого препарата с концентрацией 2-5 мг/мл и проводят развитие хроматограммы в системе 0,9-1,1 М водного раствора уксусной кислоты и этилового спирта (10:1) .

Процесс развития хроматограммы осуществляют в камере (120x200 см), насыщенной в течение 10 мин парами подвижной фазы.

Пластину с развитой хроматограммой вынимают иэ камеры и просматривают ,под хемископом в УФ- свете, контуры пятен обводят карандашом, измеряют.

R каждого пятна, идентифицируя их по сравнению с эталонными образцами, величины К 1 которых определены аналогичным образом ранее.

П р и м ер 1. На аминопропилированную пластину (5 х 10 см) "Силуфол УФ-254" наносят 4 мкл раствора уридин-5 -монофосфата в О,1 М МньОН

39588 2 (концентрация 5 мг/мл), содержащего примеси цитидин-5 -монофосфата, аде" лозин-5 -монофосфата, уридина, аденозина. Пластину с нанесенной на нее анализируемой смесью помещают в камеру, насыщенную парами подвижной фазы

IN водного раствора уксусной кислоты и этанола при соотношении компонентов 10:1. Величины R2 разделенных компонентов равны для уридин-5 -" монофосфата О; аденозин-5 -монофосфата 0,22; цитидин-5 -монофосфата

0,43; аденозина 0,69; уридина 0,76.

Пример 2. На аминопропилированные пластины (5x10 см) "Силу-. фол УФ-254" наносят по 4 мкл смеси, содержащей аденозин, аденозин-5 -монофосфат и уридин-5 -монофосфат в

О,1 M NH..0Í, Пластины подсушивают на щб воздухе и помещают в камеру (120 х х 200 см), насыщенную парами применяемой подвижной фазы в течение

10 мин. Проводят восходящую хроматографию в системах растворителей при р соотношении компонентов (10:1):

1) 0,25 М СН СООН-С Н ОН;

2) 0,50 M СН СООН-С H ОН;

3) 0,9 М СН СООН-С Н ОН;

4) 1,О М СН СООН-.С Н ОН;

5) 1,1 M СН СООН С Н ОН, 35

6) 2,0 М СН СООН-С Н ОН;

Влияние концентрации уксусной кислоты в подвижной фазе на селектив4о ность иллюстрируется табл.1.

239588 4 вижной фазе, используемой в извест ном способе 0,2 ИйаС1 в смеси

С Ня ОН-Н О (30: 7 0)

Величины R рибонуклеотидов и дезоксинуклеотндов приведены .в табл .3.

Таблица 3

Пример 3. Анализ компонен- Компонент тов нуклеиновых кислот проводят, как в примере l,.но варьируют объемное соотношение компонентов элюирую; щей системы. Данные по разделению

Предлага- Известемый ный анализируемых компонентов нуклеиновых кислот и величины К представлены в табл.2.

Влияние объемного соотношения компонентов подвижной фазы на величины R< представлены в табл.2.

Т а блица 2

Уридин-5 монофосфат

0,25

0,2

Цитидин-55— монофосфат

0,25

0,4

Аденозин-5 монофосфат

0,3

0,27

Величины R в подвиж1 ной фазе 0,9-1,1 М

СН>СООН-С Н ОН при соотношенйи компоненКомпоненты

Гуаноэин-5 5 монОфОсфат

О,l

0,12 тов

Деэокси-

10:1 10:2 аденозин-5 монофосфат

9:2

0,34

0,28

Дезоксицитидин-5 ,монофосфат

0,79 . 0,76 0,68

Уридин

0,48

Аденозин-5—

МОНОфОС фат

0,27

Тимидин-5 .— .35 монофосфат

0 14 0,22 О,ll

0,20

0,30

ДезоксиI гуаноэин-5

40 монофосфат

0,14

0 14

Из табл.2 следует, что наилучшее. разделение происходит при соотношении компонентов в подвижной фазе

l0:), Пример 4. Разделение смеси рибонуклеотидов и дезоксинуклеотидов проводят в подвижной фазе 0,9l,1 М СН СООН-С Н ОН (10:1) и в под3 1

Из данных табл.l следует, что наилучшая селективность достигается при применении подвижной фазы 0,91,1 М СН СООН-С Н ОН.

Применение 2М СН СООН в составе подвижной фазы нецелесообразно, так как высокая концентрация разрушает люминофор и фон пластины темнеет.!

Цитидин-5— онофосфат 0,34 0 43 0,31

Уридин-5— онофосфат . 0 0

Из данных табл.3 видно, что в известном способе .смесь рибонуклеотидов и смесь дезоксинуклеотидов не разделяется.

Пример 5 . Разделение (анало« гично примеру 1) нуклеозидов и их фосфатов осуществляют в подвижной фазе .0,9-1,1 М СН СООН-С Н ОН при соотношении компонентов 10:l.

Величины R< нуклеозидов и их фосфатов в системе даны в табл,4.

1239588

Разделяемые компоненты

0,75

Де зок сицитидии

Деэоксиаденозин

Дезокеицитидин-5 монофосфат!

Дезоксиаденозин-5 монофосфат

0,55

0,62

Дезоксиаденозин-5 дифосфат

Дезоксицитидин-5 дифосфат

0,56

0,39

Деэоксицитидин-5 трифосфат

Дезоксиаденоэин-5 трифосфат.

0,44

0,19

Гуанозин

Дезоксигуанозин

0,75

0,71

Дезоксигуаноэин-5— монофосфат

Гуанозин-5 монофосфат

0,53

0,56

Дезоксигуанозин-5 дифосфат

Гуанозин-5 дифосфат

0,41

0,30

Дезоксигуанозин-5 трифосфат

Гуанозин-5 трифосфат

0,10

0,12 0,74

Уридин

Уридин-5 монофосфат

0,79

0,51

0,66

Уридин-5 — дифосфат

0,59

0,57

Уридин-5 трифосфат

0,79

0,44

Цитидин.

0,76

Цитидин 5 - монофосфат Цитидин-5 — дифосфат

0,60

0,54

Цитидин-5 трифосфат

0 38

Иэ. данных табл.4 следует, что в предлагаемом способе достигается селективное разделение; фосфорных производных рибо- и дезоксинуклео" тидов.

Формула изобретения

Способ разделения нуклеиновых кислот методом тоикослойной хроматогра55

ВНИИПИ Заказ 3389/43

Тираж 778 Подписное

Произв.-полигр. лр:-тие, r. Ужгород, ул. Проектная, 4

Аде козин

Аденозин-5монофосфат

Аденозин-5 — дифосфат

Аденозин-S — трифосфат

Разделяемые к6мд@ненты К фии на пластине, покрытой силикагелем, содержащим на поверхности аминопропильиые группы, в подвижной фазе на основе этанола,о т л и ч а ю— шийся тем, что, с целью упроще ния способа и повышения его селективности, в качестве подвижной фазы используют смесь 0,9-1,1 М водного рас твора уксусной кислоты и этанола при соотношении компонентов )О:1.