Способ получения бактериального концентрата мезофильных молочно-кислых стрептококков

 

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

„„SU„„1242097 А1 дц 4 А 23 С 9 12, С 12 N 1 20

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К А BTOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ 00

gm

"„ 0 в 00 4z

\ C

Садерианае саларазы

Ц Оеар

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3641319/28-13 (22) 30.06.86 (46) 07.07.86. Бюл. № 25 (7l ) Всесоюзный научно-исследовательский институт молочной промышленности (72) И. В. Лагода, Л. А. Банникова, Н. А. Бавина и Г. В. Косарева (53) 637.13 (088.8) (56) Авторское свидетельство СССР № 1159949, кл. С 12 N 1/04//А 23 С 9/12, 16. 12.82. (54) (57) !. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БАКТЕРИАЛЬНОГО КОНЦЕНТРАТА МЕЗОФИЛЬНЫХ МОЛОЧНО-КИСЛЫХ СТРЕПТОКОККОВ, предусматривающий приготовление питательной среды на основе молочной сыворотки с добавлением аминокислотномикроэлементно-витаминного комплекса аммивита в количестве 0,5 — 0,8%, буферных солей, микроэлементов, внесение закваски, культивирование с регулированием рН, выделение биомассы клеток из культуральной жидкости и смешивание ее с защитной средой, содержащей фитин, отличающийся тем, что, с целью повышения содержания бактериальных клеток мезофильных молочно-кислых стрептококков в концентрате и увеличения стойкости его при хранении, на стадии культивирования в питательную среду вносят

1% обезжиренного молока, 0,3% гидролизата казеина и 0,00015% пепсина, а в защитную среду дополнительно вводят сахарозу, лимонно-кислый натрий и крахмал, при этом соотношение биомассы выделенных клеток и защитной среды устанавливают соответственно равным 1:2 — 1:4, при котором содержание сахарозы, лимонно-кислого натрия, крахмала и фитина в полученной суспензии составляет 1,33 — 1,6; 3,33

4; 1,0 — 1,2 и 0,13 — 0,16% соответственно.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что после смешивания биомассы выделенных клеток с защитной средой проводят замораживание с последующей сушкой при температуре — 35 С в начале процесса и

+30 С в конце процесса.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что сахарозу, лимонно-кислый натрий, крахмал, фитин вводят в защитную среду в количествве 2, 5; 1,5; и 0,2% соответственно.!

242097

Изобретение относится к технической микробиологии, а именно к получению бактериального концентрата, используемого для приготовления производственной закваски, минуя лабораторную, и для непосредственного приготовления продукта — творога, сметаны, простокваши обыкновенной.

Целью изобретения является повышение содержания бактериальных клеток мезофильных молочно-кислых стрептококков в концентрате и увеличение стойкости его при хранении.

На фиг. 1 дана зависимость клеток мезофильных молочно-кислых стрептококков после замораживания и высушивания в зависимости от различного содержания сахарозы в суспензии; на фиг. 2 — то же, при содержании в суспензии 1,6% сахарозы и различном содержании лимонно-кислого натрия; на фиг. 3 — то же, при содержании в суспензии 1,6% сахарозы, 4% лимоннокислого натрия и различном содержании крахмала; на фиг. 4 — то же, при содержании в суспензии 1,6% сахарозы, 4% лимонно-кислого натрия, 12% крахмала и различном содержании фитина.

Способ предусматривает приготовление питательной среды на основе молочной сыворотки с добавлением аминокислотно-микроэлементно-витаминного комплекса — аммивита в количестве 0,5 — 0,8% буферных солей, микроэлементов, внесением закваски, культивирование с регулированием рН, выделение биомассы клеток из культуральной жидкости и смешивание ее с защитной средой, содержагцей фитин. На стадии культивирования в питательную среду вносях 1 % обезжиренного молока, 0,3% гидролизата казеина и 0,00015% пепсина. В защитную среду дополнительно вводят сахарозу, лимонно-кислый натрий и крахмал. Соотношение биомассы выделенных клеток и защитной среды устанавливают соответственно равными от

1:2 до 1:4.

При этом содержание сахарозы, лимоннокислого натрия, крахмала и фитина в полученной суспензии составляет 1,33 — 16; 3,33-4; 1,0 в 1,2; 0,13 в 1,16% соответственно.

Предпочтительно при осуществлении способа после смешивания биомассы выделенных клеток с защитной средой проводить замораживание с последующей сушкой при температуре — 35 С вначале процесса и

30 С в конце процесса.

Целесообразно сахарозу, лимонно-кислый натрий, крахмал и фитин вводить в защитную среду соответственно в количествах 2,5; 1,5 и 02%

Максимальное увеличение роста клеток на 12 — 25% наблюдалось при внесении аммивита в количестве 0,5 — 0,8% от массы среды.

При внесении аммивита в количестве

0,8 — -1,5% от массы среды дальнейшего увеличеHèÿ роста клеток не происходит. Амми.)

IÎ !

2. >

gs

4О

4с

ss вит имеет очень низкое рН и при его внесении значительно снижается рН среды культивирования.

Кислотный гидролизат казеина содержит не только аминокислоты, но также пептиды и другие фракции белка, которые необходимы для роста микроорганизмов. Опытным путем установлено, что оптимальным является добавление в среду в процессе культивирования 0,3% гидролизата казеина. Большее количество гидролизата казеина тормозит рост мезофильных молочно-кислых стрептококков, а меньшее дает увеличение количества клеток всего на 10 — 15%.

Пепсин является протеолитическим ферментом животного происхождения, который проводит гидролиз белков молока до аминокислот, которые хорошо усваиваются мезофильными молочно-кислыми стрептококками и стимулируют их рост.

Введение в среду пепсина является целесообразным лишь в сочетании со стерильным обезжиренным молоком. Оптимальным является введение в среду 0,00015% пепсина и 1% обезжиренного молока. Среда обогащается серосодержащими дикарбоновыми ароматическими аминокислотами.

Содержание незаменимых аминокислот значительно увеличивается — лизина в 2,5 ра за, метионина в 1,7 раза, валина в 1,2 раза, фенилаланина в 5,2 раза.

При внесении 1,5% обезжиренного молока количество незаменимых аминокислот увеличивается и количество клеток увеличивается на 18- — 20%.

При внесении 0,6 — 0,8% обезжиренного молока количество клеток увеличивается всего на 9 — 12%. Внесение большего количества пепсина не дает заметного увеличения содержанию аминокислот, а снижение его количества приводит к недостаточному гидролизу белков молока, что отрицательно влияет на рост клеток.

При соотношении биомассы и защитной среды 1:4 содержание сахарозы в защитной среде составляет 2%, лимонно-кислого натрия 5%, крахмала 1,5%, фитина 0,2%.

При соотношении биомассы и защитной среды 1:2 на 1", кг биомассы берут 24 кг защитной среды и полученная суспензия в количестве 36 кг содержит 1,33% сахарозы, 3,33% лимонно-кислого натрия, 1% крахмала и 0,13% фитина.

Защитные среды устраняют вредное действие кислорода., не дают пересыхать бакконцентрату, регулируют осмотическое давление. как внутри клетки, так и вне ее.

Устойчивость клеток к замораживанию и высушиванию в значительной степени зависит от природы и концентрации криозащитных веществ, содержащихся в защитных средах.

При исследовании выживаемости мезофильных молочно-кислых стрептококков в защитной среде, содержащей различные коли1242097

20

30 чества сахарозы, лимонно-кислого натрия, крахмала, фитина, установлено, что эвтектическая зона суспензии клеток (смесь биомассы с защитной средой) находится в пределах от — 25 до — 35 С. При этом в суспензии клеток содержится сахарозы 1,33—

1,6%, лимОннО-кислого натрия 3,33 — 4%, крахмала 1 — 1,2%, фитина 0,13 — О,! 6%.

Согласно фиг. 1 — 4 самая высокая выживаемость клеток при замораживании и высушивании наблюдается при содержании в суспензии клеток указанного количества ком— понентов.

Увеличение содержания компонентов в защитной среде приводит к снижению эвтектической зоны до температуры от — 40 С до — 45 С, продолжительность сушки увеличивается, количество клеток остается на прежнем уровне, Опытным путем было установлено, что при температуре — 35 С в начале сушки и при досушивании при +30 С отмечалась лучшая сохраняемость клеток в суспензии клеток (89 — 95%).

Снижение температуры в начале процесса сушки значительно увеличивает продолжительность сушки, а повышение температуры досушивания (до 35 — 40 С) приводит к большой гибели клеток (82 — 85%).

Пример 1. Для приготовления сухого бактериального концентрата мезофильных молочно-кислых стрептококков берут 260 л сыворотки из-под творога с рН 4,5, добавляют 5 л аминокислотно-микроэлементновитаминного комплекса и все нагревают в ванне ВДП до 93 С и выдерживают при этой температуре 60 мин.

Для приготовления 1000 л среды сыворотку с аминокислотно-микроэлементно-витаминным комплексом смешивают в ферменторе с 650 л питьевой воды и добавляют 10 кг лимонно-кислого натрия и 165 г сернокислого марганца. Устанавливают реакцию среды 25%-ным водным раствором аммиака до рН 6,5.

После этого проводят стерилизацию при

118 С (давление 0,08 МПа) и выдерживают при этой температуре 60 мин, а затем охлаждают до 30 С. В подготовленную среду вносят 30 л закваски, приготовленной на стерилизованном обезжиренном молоке. 45

Через 3 ч культивирования в ферментер вносят 10 л стерилизованного обезжиренного молока, 1,5 г пепсина (предварительно растворенного в 100 мл стерильного физиологического раствора) и 3 л стерилизованного гидролизата казеина.

Выращивание мезофильных молочно-кислых стрептококков проводят в течение 10 ч в условиях периодического культивирования, поддерживая рН на уровне 6,5 путем постоянной нейтрализации среды 25%-ным раствором аммиака.

После окончания процесса культивирования культуральную жидкость охлаждают до 10 С и направляют на бактофугирование.

Из 1000 л среды получают 12 кг биомассы. В биомассе определяют количество клеток. Для этого берут две пробирки с

10 мл стерильной воды, подогретой до 30 С.

B одну пробирку отвешивают 1 г биомассы, хорошо ее перемешивают с водой, так чтобы не было комочков. В другую пробирку наливают 1 мл рабочего раствора резазурина. Содержание двух пробирок соединяют в одну пробирку, закрывают резиновой пробкой, смешивают путем медленного трехкратного переворачивания пробирки. Пробирку помещают в водяную баню при 30 С.

Обесцвечивание резазурина произошло за

1 мин. Поэтому биомассу смешивают с защитной средой в отношении 1:4. Защитной среды берут 48 кг. Защитная среда состоит из 4900 мл 20%-ного раствора сахарозы, стерилизованной при 112 С в течение 30 мин, 6000 мл 40%-ного раствора лимонно-кислого натрия, стериллизованного при 121 С в течение 15 мин. 13091 мл 5,5%-ного раствора крахмала, стерилизованного при 135 С в течение 2 ч и 24009 мл воды с внесенными в воду 96 г фитина, стерилизованного при

135 С в течение 2,5 ч. Затем все составные части в асептических условиях сливают и получают 48000 мл защитной среды. Затем

12 кг биомассы смешивают в асептических условиях на системе с 48000 мл защитной среды.

Полученную смесь разливают во флаконы по 7 мл. Затем флаконы помещают на лотки и замораживают при температуре — 50 С в течение 5 ч и сушат сублимационным методом при следующих режимах: начальная температура сушки — 35 С, конечная температура досушивания +30 С, температура конденсатора минусовая, остаточное давление 1,1 Па, продолжительность сушки 36 ч.

Флаконы закрывают стерильными полиэтиленовыми пробками и закрывают алюминиевыми колпачками. Получают 6,5 тыс, порций сухого бактериального концентрата. В 1 г (порции) сухого бактериального концентрата содержится 350 млрд. клеток.

Пример 2. Для приготовления сухого бактериального концентрата мезофильных молочно-кислых стрептококков берут 260 л сыворотки из-под творога с рН 4,6, добавляют

5 л аминокислотно-микроэлементно-витаминного комплекса и все нагревают в ванне

ВДП до 97 С и выдерживают при этой температуре 70 мин.

Затем сыворотку освобождают от белков сепарированием. Для приготовления 1000 л среды в ферментере смешивают 250 л осветленной сыворотки с аминокислотно-микроэлементно-витаминным комплексом с 650 л питьевой воды и добавляют 10 кг лимоннокислого натрия и 165 r сернокислого марганца. Устанавливают реакцию среды

1242097

7g

И

< Z 40 я

< 20

4 rg >

oо5oеeрp иаoнwае e лnuик cанwнс ч пucсл аozга o ю ciлvpрuиу+

@аг.2

25% ным водным раствором аммиака до рН 6,8.

После этого проводят стерилизацию среды при 118 С (давление 0,08 МПа), и выдерживают при этой температуре 65 мин, а затем охлаждают до 30 С.

В подготовленную среду вносят 50 л закваски мезофильных молочно-кислых стрептококков, приготовленной на стерилизованном обезжиренном молоке.

Через 4 ч культивирования в ферментер вносят 10 л стерильного обезжиренного молока, 1,5 г пепсина (предварительно растворенного в 100 мл стерильного физиологического раствора) и 3 л стерильного гидролизата казеина. 15

Выращивание мезофильных молочно-кислых стрептококков проводят в течение 12 ч в условиях периодического культивирования, поддерживая рН среды на уровне 6,8 путем постоянной нейтрализации среды 25%ным раствором аммиака. 20

После окончания процесса культивирования культуральную жидкость охлаждают до

8 C и направляют на бактофугирование.

Из 1000 л среды получают 10 кг биомассы.

Осветлень резазурина проходит за 3 мин.

Поэтому б»кконцентрат смешивают с защитной средой в соотношении 1:2, т.е. защитной среды 20000 мл.

Защитная сред» состоит из 2000 мл 20%ного раствора сахарозы, предварительно стерилизованной при 0,05 МПа, что соответствует 114 "С в течечие 25 мин; 2500 мл

40%-ного раствора лимонно-кислого натрия, предварительно стерилизованного при 122 С в течение 12 мин; 5454,5 мл 5,5%-ного раствора крахмала, ripeдваритепьно стЕрилизованного при 138 С в течение 2,5 ч и

40 г фитина, помещенного в 10045,5 мл дистиллированной воды и все стерилизуют при

138 С в течение 2,3 ч. Затем все составные части в асептических условиях сливают и получак>т 20000 мл загцитной среды. Затем

10 кг биомассы смешивают в асептических условиях на смесителе с 20000 мл защитной среды.

Полу военную смесь разливают во флаконы по 6 мл. Затем флаконы помещают на лотки и замораживают при температуре — 50 С в течение 6 ч и сушат сублимационным способом при следующих режимах: начальная температура сушки — 35 С, конечная температура досушивания +30 С, температура конденсатора — 60 С, остаточное давление 0,45 Па, продолжительность сушки

28 ч.

Затем флаконы закрывают полиэтиленовыми пробками я закатывают алюминиевыми колпачками. Получают 4,5 тыс. порций сухого бактериального концентрата, в 1 г (порции) сухого бактериального концентрата содержится 300 млрд. клеток.

Порция концентрата в 1 г (после ее предварительной активизации) свертывает

2000 л молока, псдготовленного для выработки творога за 6 — 8 ч или 2000 л сливок при сквашивании за 12 — 14 ч.

Сухой бакконцентрат сохраняет свою> активность в течение 4 мес. и в сравнении с жидким имеет более высокую стойкость и высокую активность, что позволяет его использовать непосредственно при приготовлении продукта.

Таким образом, изобретение обеспечивает повышение содержания бактериальных клеток мезофи lbklblx молочно-кислых стрептококков в концентрате и увеличение стойкости его при хранении.

1242097

3 70 Я ъ Я о у Я

® О

1g

М3ержанце рлжюло

" 50

40 а Ю

Ъ я сь

10 сС)

Оо0ержание (ритина

Составитель Л. Горбачева

Редактор Г. Волкова Техред И. Верес Корректор Л. Патай

Заказ 3633/5 Тираж 543 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, )К вЂ” 35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП «Патент>, г. Ужгород, ул. Проектная, 4