Способ определения дефектности лимфоцитов

 

СОЮЗ СО8ЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК (19) (И) А1 д)) 4 А 61 К 39/ОО,G О1 N 33/49

ГОСУДАРСТ8ЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

IlO ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЬГГИЙ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ:,, Н АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Ыл .;„-) 1ултЬА (21) 36597 17/28-14 (22) 09.11.83 (46) 30. 09. 86. Бюл. И 36 (71) Киевский научно-исследовательский институт педиатрии, акушерства и гинекологии им. проф, Н.М. Буйка (72) В.Д.Отт, В.П.Черньппов, Н.А.Грегуль и В.В. Головатюк (53) 615 ° 375 (088 ° 8) (56) Jondal М.еt al Surfaces

markers on human Т and В lymphocytes X.À. large population of lymphocytes .forming nonimmune rosettes with

shepp ей blood се11. - J. exp;med, 1972 ° 136, 207. (54)(57) 1. СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДЕФЕКТНОСТИ ЛИ1лФОЦИТОВ путем определения количества Т- и В-лимфоцитов в периферической крови с помощью реакций Е- и ЕАС-розеткообразования, о т л и ч а ю ш и и с я тем, что, с целью повышения точности способа, лимфоциты делят на две пробы, в одну из которых добавляют 1-2 мкмоль раствора третичной перекиси бутила, после определения количества лимфоцитов в обеих пробах их сравнивают и при снижении количества лимфоцитов более чем на 5Х в обработанной пробе определяют дефектность лимфоцитов ..

2. Способ по п.1, о т л и ч а юшийся тем, что обработку раствором третичной перекиси бутила вео дут в течение 30 мин при 37 С.

1260006

Изобретение относится к меди«ине, н частности иммунологии, а именно к методам диагностики иммунологической реактивности организма.

Целью изобретения является повышение точности способа определения дефектности лимфоцитов крови.

Способ осуществляют следующим образом, Иэ вены больного набирают 3,5

15,,0 мл крови, которую помещают в пробирку с 0,1 мл гепарина. В центрифужную пробирку наливают 2 мл фиколл-верографиновой смеси, затем осторожно и нее наслаивают разведенную изотоническим раствором хлорида натрия (1:1) кровь, центрифугируют

20 мин при 400 (. После этого из пробирки сливают все слои до кольца, которое пипеткой снимают в отдельную пробирку. В нее добавляют 5-6 мл среды 199. Центрифугируют при 400 G, днажды н течение 10 мин. Надосадочную жидкость сливают, осадок ресуспендируют с 0,5 мл надосадоч— ной жидкости. Во вэве<.и определяют количество лимфоцитов путем их одсчеra н камере Горяева известным методом. Взвесь лимфоцитон разливав ют н дне пробирки по 0,1 мл н каждую. Б обе пробирки добавляют по

0,1 мл 1-2 мкмоль раствора третичr

+37 С, после чего центрифугируют

10 мин при 400 С<, за" åì отбирают по

0„1 мп надосадочной жидкости иэ каждой пробирки. В первую гробирку добавляют О, 1 мп 0,5/ †н взвеси эритроцитон барана и ставят в холодильник на 1 ч при +4 С (для определения Е-РОК). Во вторую пробирку добавляют 0,1 мл 27-ной сус— пензии эритроцитов барана, обра ботанных мьшп ным комплементом, выдерживают н термостате 30 мин пр,л

+37 С (для определения ЕАС-PÎK).

После ныдерживания обе пробирки центри<ругируют 10 мин при 50 g реЬуспендлруют. На предметное стекло наносят 1 каплю взвеси и под микроскопом подсчитывают число лимфоцитон, присоедиылвших не менее трех эритроцитов, и их процент по отношению к общему числу лимфоцитон. Срав— нивая количество Т- и В-клеток (7.) н пробах, полученных после обработки третичной перекисью бутила, и в пробах, где их количество опре5 !

О !

55 делялось известным методом, рассчи— тынают (/) степень снижения числа

Т- и В-клеток. При снижении количества Т- и В-клеток более чем на

57 по сравнению с исходным диагностируют дефектность лимфоцитов.

II p и м е р 1. У больного Б.А. из периферической вены взяли 4 мл крови, перенесли в пробирку с 0,1 мл гепарина, развели изотоническим раствором хлорида натрия 1:1. Затем наслоили на 2 мл фиколл-верографино— вой смеси, отцентрифугировали

20 мин при 400 Я. Выделенное кольцо дважды отцентрифугировали с 5 мл среды 199 в течение 10 мин при 400 (.

Определили количество лимфоцитов в осадке. Ресуспендированную взвесь разлили по 0,1 мл в 4 пробирки. В первой и второй определили число Ти В-лимфоцитов (E- и ЕАС-POK). В третью и четвертую пробирки добавили по О, 1 мп 1 мкмоль раствора третичной перекиси бутила и выдержали в о термостате при +37 С в течение

30 мин, по сле че го отце нт рифугир свали при 400 G в течение 10 мин.

Отобрали из каждой пробирки по 0,1 мл надосадочной жидкости. В полученном осадке определили число Т- и Влимфоцитов (А- и ЕАС-POK). Выявлено, что в не обработаннои третичнои пе рекисью бутила взвеси количество Ти В-лимфоцитон составило соответственно 30 и 347.. Во взвеси, обработанной 1 мкмоль раствором третичной перекиси бутила, число Т вЂ” и В-лимфоцитон составило соответственно

20 и 237.. Число Т-лимфоцитов после обработки уменыпилось на 337., В-лимфоцитов — на 327

Диагностирована дефектность лимфоцитов, сопровождающая неосложненную острую пневмонию. Диагноз: двусторонняя очаговая бронхопневмония, острое течение.

Пример 2. У больного С. В. иэ периферической вены взяли 3,5 мл крови, перенесли в пробирку с 0,1 мл гепарина, развели иэотоническим раствором хлорида натрия 1:1. Затеи наслоили на 2 мл фиколл-верографиновой смеси, отцентрифугировали в течение 20 мин при 400 Ц, определили количество лимфоцитов в осадке. ВыФ деленное кольцо дважды отцентрифугировали с 5 мл среды 199 в течение

10 мин при 400 G. Ресуспендированную взвесь разлили по 0,1 мл по 4 пробир06

Показатели иммунит е та (р) До стов ерно сть

Тяжесть заболевания

Здоровые дети (n=10) Неосложнен-. Осложненное ное (n=25) (n=25) 2-3

1-3

1-2 0,1

<0,001

Т 55,0+0,2 3 1, 4+О, 7 30,4+0,5

<0.,001 (0,001

<0, 001 <0,001 0,001 0,001 (О 01 <О 001

Т, 54,8+0,5 23,5+0,5 15,8+0,6

)0,2

В 22,5+0,4 30,8+0,8 31,7+0,6

В, 22, 2 0, 2 23,9+0,6 16, 3+0,6

<О 001.

Лимфоциты без третичной перекиси бутила.

Лимфоциты после инкуЯции с третичной перекисью бутила.

3 12600 ки. В первой и второй определили число Т- и В-лимфоцитов (E- и ЕАС-РОК).

В третью и четвертую пробирки добавили по 0,1 мл мкмоль раствора третичной перекиси бутила, выдержали в тер- мостате при +37 С в течение 30 мин, после чего отцентрифугировали при

400 С1 в течение 10 мин. Отобрали из каждой пробирки по 0,1 мл надосадочной жидкости. В полученном осадке ,определили число Т- и В-лимфоцитов (Е- и ЕАС-РОК).

Выявлено, что в не обработанной третичной перекисью бутила взвеси клеток число Т- и В-лимфоцитов сос15 тавило соответственно 33 и ЗОЖ. Во взвеси, обработанной 1 мкмоль раст— вором третичиой перекиси бутила, количество Т- и В-клеток после обра- ботки уменьшилось на 39Х, В-клеток — на 50Х.

Диагностирована дефектность лимфоцитов, сопровождающая осложненную ,острую пневмонию. Диагноз: двусторонняя бронхопневмония, токсическая .форма, бронхообструктивный и кардио! респираторный синдром, острое тече.ние.

Как следует из приведенных примеров,количество T- и В-лимфоцитов в периферической крови было примерно ЭО одинаковым, хотя тяжесть заболевания была различной. Использование предложенного метода оценки дефектности лимфоцитов путем определения процента снижения числа Т и В лим 35 фоцитов после их обработки раствором третичной перекиси бутила показало, что во втором случае снижение числа

Т- и В-лимфоцитов было более выраженным, чтю соответствовало большей тя- 4О жести заболевания.

Ис следов ания проведены у 50 детей, больных острой пневмонией, а также у 10 здоровых детей в возрасте 1 .6 мес.

Результаты проведенных исследований, а именно чувствительность

Т- и В-лимфоцитов к действию перекисей при неосложненной и осложненной пневмонии (M+m) в процентах, приведены в таблице.

Как следует из данных, представленных в таблице, использование предлагаемого способа позволяет установить наличие дефектности лимфоцитов между группой здоровых детей и детьми, больными неосложненной пневмонией, в то время, как использование известного способа не поз- воляет выявить дефектность лимфоцитов между данными группами детей.

Определение числа T- и В-лимфоцитов в крови, не обработанной третичной перекисью бутила не выявило досто) верных различий их ур ов ня между группами детей, больных осложненной и неосложненной пневмонией. При применении предлагаемого способа с высокой степенью достоверности (P > 0,001) выявляется дефектность лимфоцитов у детей указ анных групп.

Таким образом, применение изобретения позволяет повысить точность определения дефектности лимфоцитов, в частности выявить дефектность лимфоцитов при неосложненной пневмонии.

Изобретение может быть использовано при диагностике пневмоний и других заболеваний, сопровождающихся нарушением иммунологической "реак- тивности организма. э