Способ диагностики гепатита

 

СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ГЕПАТИТА путем смешивания крови больного с антикоагулянтом, выделения клеток лимфомоноцитарной смеси и подсчета из них фиксированных на стекле, отличающ и и с я тем, что, с целью дифференциальной диагностики хронического персистирующего и хронического активного гепатита в период ремиссю, лимфомоноцитарную смесь наносят на стекло в виде висячей капли , при этом смесь готовят на среде с 10% пулированной сыворотки АВ группы крови и берут в концентрации 2, кл/мп, и при показателе фиксированных клеток от 9 до 36% диагностируют хронический активиый гепатит, а при показателе фиксированных клеток от 1 до 8% - хроцический персистирующий гепатит.

СООЗ СОЕЕТСНИХ ц Р

РЕСПУБЛИК

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н АВТОРСНООТ СВИДВТОЛЬСТВТ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3480602/28-13 (22) 03.08.82 (46) 23.02.85. Бюл. Р 7 (72) А. Ф. Блюгер, Х. М. Векслер, Ж. П. Тимошенко, Н. А.:Оспа и Л. Е. По-. луэктова (71) Рижский медицинский институт (53) 616-098.8 (088.8) (56) 1. Desmet Ч. $. 0ie Morfogenese der

chronischen Hepatitis Munch,: med Oschr, .

1978, v. 120, w. 46, р. 1523-1532.

2. Авторское свидетельство СССР

Р 594965, 28.02.78. (54) (57) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ ГЕПАТИТА путем смешивания крови больного с

„„SU„„1141 Об А

4(51) G 01 Й 1 28 А 61 В 1000 антикоагулянтом, выделения клеток лимфомоноцитарной смеси и подсчета из них фиксированных на стекле, о т л и ч а ющ н и с я тем, что, с целью дифференциальной диагностики хронического персистирующего и хронического активного гепатита

s период ремиссии, лимфомоноцитарную смесь наносят на стекло в виде висячей капли, при этом смесь готовят на среде с

10% пулированной сыворотки АВ группы крови и берут в концентрации 2,5х10 кл/мл, и нри показателе фиксированных клеток . от 9 до 36% диагностируют хронический активный гепатит, а при показателе фиксированных клеток от 1 до 8% — хронический персистирующий гепатит.

1141306

20

Изобретение относится к медицине и касается способа диагностики гепатита.

Известен способ дифференциальной диагностики хронического активного гепатита д стадии ремиссии и хронического персистирующего гепатита 111.

Однако диагностика затруднена из-за сходства клинико-биохимических и морфологических проявлений болезни.

Известен способ диагностики гепатита, заключающийся в том, что смешивают кровь больного с антикоагулянтом, вьщеляют лимфомоноцитарную смесь, подсчитывают клетки, прилипшие (фиксированные) на стекле (2).

Однако известный метод обеспечивает диагностику острого вирусного гепатита В и не отграничивает хронический персистирующий гепатит и хронический. активный гепатит в период ремиссии.

Целью изобретения является дифференциальная диагностика хронического персистирующего гепатита и хронического активного .гепатита в период ремиссии.

Указанная цель достигается тем, что 25 согласно способу диагностики гепатита, включающему смешивание крови больного с антикоагулянтом, выделение клеток лимфомоноцитарной смеси и подсчет из них фиксированных на стекле, лимфомоноцитар-ную смесь наносят на стекло в виде висячей капли, при этом смеси готовят на среде с 10% пулированной сыворотки АВ группы крови и берут в концентрации

2,5x10 кл/мл, и при показателе фиксированных клеток от 9 до 36% диагностируют

35 хронический активный гепатит, а при показателе фиксированных клеток 1 — 8% хронический персистирующий гепатит.

Способ осуществляют следующим образом, У больного забирают 3 мл периферичес40 кой крови в пробирку с 60 ед. гепарина.

Лимфомоноцитарную взвесь, выделенную на градиенте плотности фиколл-верографина (1,077), разводят питательной средой 199, 45 содержащей 10% пула инактивированных сывороток доноров IY/AB/ группы крови, . до концентрации 2,5х10 клеток в 1 мл.

Из капли взвеси делают мазок для подсчета процентного соотношения лимфоцитов

50 и моноцитов, По 0,01 мл указанной взвеси (2.5х10 клеток) автоматической пипеткой наносят на два квадрата площадью 0,25 см, выгравиг рованных на предметном стекле (стекло тщательно обсзжирено кипячением в раст55 воре стирального порошка и дистиллированной воды и последующим содержанием в 96 спирте), инкубируют ) ч . при- 37 С.

Затем стекло переворачивают для образования феномена "висячей капли" и в таком положении оставляют 20 мин при комнатной температуре. Неприлипшие клетки, сконцентрированные в "висячей капле", удаляют полоской фильтровальной бумаги, которую осторожно прикладывают к краю квадрата. Затем 0,04 мл среды 199 с указанной сывороткой наносят на каждый квадрат для дополнительного отмывания неприлипших клеток. Жидкость сразу же отсасывают полоской фильтровальной бумаги.

Препарат высушивают, фиксируют 5. мин метанолом и окрашивают по Романовскому-Гимзе, Дифференцированный подсчет лимфоцитов и моноцитов производят по всей площади квадрата при световой микроскопии (увеличение х 630).

Процент прилипших клеток выечитывают по формуле:

А

Ар= х 100%, 2500 где А — общее число прилипших по всей площади квадрата клеток;

2500 — число клеток, внесенных в квадрат.

Пример расчета. Определяют процент прилипания клеток по формуле

А д = — х 100%, 0 где А, А1

М вЂ” процент прилии; — количество прилипших клеток; — количество клеток, использованных в реакции.

Тогда при

А„= 908 и М = 2500

А =36,3%; при А,= 225 и М = 2500

А =9% фри показателе процента прилипао ния 36, 3 и 9% у больного диагностируют хронический активный гепатит в стадии ремиссии); при A„=25 и М «r 2500 Аг= 1%; при А =200 и М = 2500 А„=8% (при по1 казателе процента прилипаиия 1 и 8% у больного диагносцируют хронический персистируюший гепатит) .

Пример 1. Больная О., 19 лет, клинический диагноз — хроническйй активный гепатит (диагноз выставлен в !977 г. на основании клинико-биохимических данных; слабость, желтушность, ге атоспленомегалия; АлАТ 6,25 моль; билирубии

2,5 мг%; т-глобулины 42% и инструмен1141306 4 тальных методов исследования: скенирование и пункционная биопсия печени). На основании указанного больной была назначена терапия кортикостероидами, которую проводили до 1980 r.

К январю 1980 г, достигнута клкникобиохимическая ремиссия (билирубин 0,4 мг%;

АлАТ 0,69 моль; г -глобулин 23%; жалоб нет). При ункционной биопсии печени в .

1980 г. — в препарате ткань печени беэ признаков явной патологии.

Предлагаемым способом диагностики определено высокое число прилипающих клеток (36,1%), на основании чего было диагностировано наличие хронического активного процесса в печени. При дальнейшем наблюдении за больной диагноз был подтвержден обострением процесса в августе

1981 г. (билирубин 2,5 м|%; АлАТ

3,5 моль; . г -глобулины 32%).

Больная находится на диспансерном наблюдении. В течение 1981 — 1983 r, постоянно принимает поддерживающие дозы преднизолона из-за периодического повышения АлАТ,, Пример 2. Больная П., 58 лет, клинический диагноз — хронический актив. ный гепатит, развивающийся после тяЖелой формы вирусного гепатита, перенесенного в

1978 г. Диагноз выставлен на основании клинико-биохимических данных и морфологического исследования печени. Больную лечили преднизолоном и к маю 1980 r. была. достигнута клинико-биохимическая ремиссия (билирубин 0,7 мл%; АлАТ 0,13 моль;

Т-глобулины 23%).

Предлагаемым способом диагностики в этот период определено высокое число прилипающих клеток (9,0%) и диагностировано наличие хронического активного процесса в печени, что подтверждено результатом морфологического исследования (при пункционной биопсии печени в препарате выявлен перипортальный гепатит с переходом в, цирроз печени) и дальнейшим наблюдением за больной: в сентябре 1981 r. больная поступила в клинику с тяжелым обострением процесса (билирубин 11,3 мл%; АлАТ

4,3 моль; Т-глобулины 43%). С этого времени находится на диспансерном наблюдении и поддерживающих дозах преднизолона (нестойкая ремиссия).

Пример 3. Больной К., 47 лет.

В 1979 г. перенес острый вирусный гепатит в средней тяжести. В дальнейшем сохранилось персистирование НВ А при несколько цовышенном содержании билирубина (1,8 ьп|%) и активности АлАТ (1,29 моль).

При исследовании предлагаемым методом число прилипающих клеток составило 1,1%, 5

f5

SS на основании чего был выставлен диагноз: хронический персистирующий гепатит (исследование проведено 02.01.80). Позже диагноз подтвержден результатом морфологического исследования (при пункционной биопсии выявлен нерипортальный гепатит, т.е. хронический персистнрующий гепатит).

В течение последующих двух лет обострений заболевания отмечено не было, но при биохимическом исследовании в 1981 г. выявлено повышенное содержание АлАТ (1,68 моль) при нормальных значениях бнлирубина (0,7 мл%) и осадочных проб (сулемовая проба 80%; тимоловая 4,5 ЕД), что свидетельствует о наличии невыраженного воспалительного процесса в печени благоприятного течения, при котором применение кортикостероидов не показано.

Пример 4» Больной Б ., 25 лет.

В октябре 1979 г. перенес острый вирусный гепатит. В дальнейшем при клинико-биохими-: ческбм наблюдении за больным постоянно выявляли некоторое повышение содержания билирубина крови (?3,12.79 г. 2,5 мт%;

06.06.80 г. 1,; 05.09.80 r. 2,1 ыг%), а при морфологическом исследовании — в препарате картина портального гепатита. На основании указанных исследований больному выставлен диагноз — хронический персистирующий гепатит н с 1980 г. он находится на диспансерном учете.

Предлагаемым способом диагностики

10.10.80 г. у больного в крови определено 8% прилипающих клеток, что подтверждает указанный диагноз и свидетельствует о благоприятном течении заболевания.

Таким образом, предложенный способ диагностики позволяет в 80 — 90% случаев достоверно дифференцировать хронический персистнрующнй гепатит и хронический активный гепатит в стадии ремиссии.

В процессе экспериментальной разработки способа выявлены следующие особенности.

С помощью создания феномена "висячая капля" удается избавиться от неприлинших к стеклу клеток, не травмируя оставшиеся на стекле фикеированные (прилипшие) клетки. Прополаскивание или промывание стекла приводит к нарушению целостности клеток и сопровождается невоспроизводимостью результатов. При создании феномена "висячая капля" клетки, не прилипшие или слабо прилипшие к стеклу, в силу физических свойств стекают в каплю и удаляются фильтровальной бумагой, чем достигается максимальная стандартизация удаления клеток без нарушения их структуры и функции.

В качестве среды для инкубации лимфомоноцитарной смеси следует использовать

41306

Составитель 3. Вальковская

Техред О.Неце Корректор С. Черни

Редактор А. Шишкина

Заказ 487/31 Тираж 897 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж вЂ” 35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал !1ПП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4 Э ll смесь питательной среды с 10% пулированной сыворотки крови доноров АВ (IV) группы. Использование физиологического раст.вора или фосфатного буфера вместо питательной среды для кратковременного культивирования приводит к снижению жизнеспособности клеток. Необходимо использовать пулированную сыворотку крови здо- . ровых доноров АВ (IV) группы крови, так как применение аутологичйой cblBoppTки неадекватно нз-за наличия в ней блокирующих факторов при хронических заболеваниях печени.

Для нанесения на стекло целесообразно использовать концентрацию клеток 2,5 х х10 в,l мл (2500 клеток на пробу).

При использовании менее,2000 клеток на пробу в случаях низкого процента прилипания на стекле оставались единичные клетки, что затрудняло оценку реакции. При использовании более 3000 клеток на пробу в случаях высокого процента прилипания подсчет прилипших клеток был затруднен из-за большого их числа и образования конгломератов, что ухудшало воспроизводимость

16 результатов.

Предлагаемый способ позволяет достоверно (в 80 — 90% случаев) дифференцировать хронический персистирующий гепатит и

15 хронический активньй гепатит в стадии

% ремиссии.