Способ определения опсонизирующей активности биологической жидкости

 

Изобретение относится к медицине , может быть использовано Для определения активности заболеваний. Цель изобретения - повышение чуествитеЛьности способа. В две опытные и в одну контрольную пробу помещают смесь лейкоцитов и стандартного штамма стафилококка, В 1-га опытную пробу добавляют исследуемую жидкость, во 2-ю пробу добавляют ту же жидкость , но инактивированнуга. В контрольную пробу добавляют сыиоротку от здоровых доноров. Пробы перемешивают , инкубируют и дважды отмывают, Из осадка каждой пробы готовят мазки. Затем пробы продолжают инкубировать. Jl3 осадка каждой пробы вновь готовят Q мазки. Все мазки фиксируют, окрашисл вают, В мазках подсчитывают фагоцитарные показатели. После этого вычисляют опсонические индексы.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК (59 4 G 01 N 33/48

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И QTHPblTWÉ Ж 2

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ /," к втсн сном свидательствм ь,., (21) 3793171/28-14 (22) 31. 07. 84. (46) 07.10,86 . Бюл. ll 37 (71) 1-й Московский ордена Ленина и ордена Трудового Красного Знамени медицинский институт им. И.М. Сеченова (72) Д.В. Белокриницкий и А.И,.Кудрявицкий (53) 616.07 (088.8) (56) Андреев В.Н., Подопригора Г.И.

Современные методы изучения опсонизирующей активности сыворотки крови. - Лабораторное дело, l977, К 8, с. 479-482, (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОПСОНИЗИРУЮЩЕй АКТИВНОСТИ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ЖИДКОСТИ (57) Изобретение относится к медицине, может быть использовано для onределения активности заболеваний, Цель изобретения — повышение чувствительности способа. В две опытные и в одну контрольную пробу помещают смесь лейкоцитов и стандартного штамма стафилококка. В 1-ю опытную пробу добавляют исследуемую жидкость, во 2-ю пробу добавляют ту же жидкость, но инактивированную. В контрольную пробу добавляют сыворотку от здоровых доноров. Пробы перемешивают, инкубируют и дважды отмывают.

Из осадка каждой пробы готовят мазки.

Затем пробы продолжают инкубировать. .Из осадка каждой пробы вновь готовят мазки. Все мазки фиксируют, окрашивают. В мазках подсчитывают фагоцитарные показатели. После этого вычисляют опсонические индексы.

1262377

Изобретение относится к медицине, а именно к терапии, и может быть ис-; пользовано для определения активности заболеваний, прогнозиров HHR ux течения, выбора лечения и его кон- 5 троля.

Цель изобретения — повышение чувствительности способа за счет количественной оценки процесса внутриклеточного переваривания, 10

Указанная цель достигается тем, что в качестве контрольной испольЪ зуют смесь сывороток крови здоровых доноров, дополнительно исследуют пробу с инактивированной путем прогревания испытуемой жидкостью, инкуба— цию проб проводят Ь течение 120 5 мин, при этом через 30 1 мин от начала инкубации в пробах определяют опсонические индексы фагоци- 20 тарной активности и поглощения тестмикроорганизмов, а после инкубации— опсонические индексы бактерицидности и завершенности фагоцитоза и по уровню полученных значений определяют опсонизирующую активность биологической жидкости.

Способ осуществляется следующим образом.

В две опытные и в одну контрольную 0 пробу помещают тест-систему, состоящую из смеси равных объемов лейкойцитов донора и музейного, стандартного штамма стафилококка., Лейкоциты получают из 8- l0 мл гепаринизированной з (25 ME/Më) венозной крови после ее отстаивания или центрифугирования при 1000 об/мин в течение 10 мин, последующего забора плазмы и лейко— цитарной пленки, двухкратного отмы- р0 вания клеток средой 199 от плазмы и антикоагулянта. Взвесь лейкоцитов разводят до концентрации 10 кл/мл. т

Микробную взвесь готовят, производя смыв стерильным физиологичес ким раст. вором с суточной культуры стафилококка, затем разводят до концентрации 10 микробных тел/мл. Смешивают

9 по 0,2 мл взвеси лейкоцитов и микробной взвеси, что дает в каждой 50 пробе постоянное соотношение микроорганизмов и лейкоцитов (100:1), В качестве объекта фагоцитоза исполь— зуют живую суточную культуру St. epidermidis штамм 9198.

В 1-ю опытную пробу добавляют

0,1 мл исследуемой жидкости (нативной), во 2-ю опытную пробу добавляют 0 1 мл той же жидкости, предварительно инактивированной путем прогревания в течение 30 мин при

+56 С.

В контрольную пробу добавляют

0,1 мл контрольной сыворотки, представляющей собой смесь свежих сывороток, полученных не более чем эа

3 ч до постановки реакции от нескольких здоровых доноров (не менее 3) .

Таким образом, концентрация опсонизирующей сыворотки в каждой пробе составляет 20Ж (по объему).

Каждую пробу тщательно перемешио вают и инкубируют при 37 С в течение

30 мин, затем дважды отмывают от опсонизирующей сыворотки теплым о (37 С) физиологическим раствором или средой 199, отбрасывают супернатант, из осадка каждой пробы готовят мазки. После этого продолжают инкубировать все 3 пробы в тех же условиях.

Через 120 мин после начала первой инкубации из осадка каждой пробы вновь готовят мазки, Все мазки фиксируют в метаноле в течение 10 мин, затем окрашивают по РомановскомуГимза в течение 10 мин, что дает возможность дифференцировать в маэ— ках, приготовленных после 120-минутной инкубации, лежащие внутриклеточно жизнеспособные и умерщвленные микроорганизмы. Световая микроскопия мазков проводилась с использованием масляной иммерсии.

В мазках, приготовленных из каждой пробы после первой (30 мин) и второй (l20 мин) инкубаций, подсчитывают следующие фагоцитарные показатели: процент фагоцитирующих нейтрофилов от общего числа, т.е. фагоцитарный индекс (ФИ и ФИ„ д ),среднее число фагоцитированных микроор-, ганизмов в 1 фагоците, т.е. фагоцитарное число (ФЧ О и ФЧ, ), коэф— фициент фагоцитарного числа (КФЧ), представляющий собой отношение ФЧэд к ФЧ, отражающее динамику показателей поглощения и завершенность фагоцитоэа, индекс бактерицидности нейтрофилов (ИБН), т.е, отношение числа лежащих внутриклеточно умерщвленных микроорганизмов к общему числу фагоцитированных нейтрофилами микроорганизмов, выраженное в процентах.

После этого вычисляют опсонические индексы по следующим формулам.

1262377

«100Z .

eq 30 о

„ 1007

КФЧ

ВНИИПИ Заказ 5420/41 Тираж 778

Подписное

Произв.-полигр. пр-тие; r. Ужгород, ул. Проектная, 4

Опсонический индекс фагоцитарной активности (ОИФЛ) равен †„ к 1003, ФИ о

ФИ эо

Опсонический индекс поглощения (ОИП) равен 5 о

Опсонический индекс бактерицидности (ОИБ) равен

ИБН, О м 1007, к

Опсонический индекс завершенности фагоцитоза (ОИЗФ) равен 5

В числителе каждой формулы — фаго20 цитарные показатели опытной пробы (с нативной или инактивированной исследуемой жидкостью), в знаменателе контрольной пробы.

Пример 1. Больная К,49 лет 25 заболела в январе 1980 r. появился сухой кашель, одышка, субфебриальная температура, слабость, недомогание, снижение аппетита. При обследовании в стационаре поставлен диаг30 ноз: саркоидоз, I стадия, с внутригрудными проявлениями (по рентгенологическим данным, подтвержденным с помощью биопсии лимфоузлов).

Больная была обследована согласно известному способу на опсонизирующую З5 способность сыворотки крови и лаважной жидкости, однако нарушение опсонизирующей активности с помощью этого способа выявлено не было, что расценили как признак отсутствия у боль40 ной активного процесса. Лечение не проводилось, I8.04.84 г. больная была обследована на опсонизирующую активность сыворотки крови и бронхо-альвеолярной жидкости согласно предлагаемому способу. Получены следующие результаты. Лаважная жидкость,7,:

ОИФА 54 (нат.) и 52 (прогр.);ОИП

51,6 (нат.) и 40,4 (прогр.); ОИБ

81,6 (нат.) и 81,0 (прогр.), ОИЗФ

96,6 (нат,) и 94,8 (прогр.). Сыворотка крови,X: ОИФА 97;8 (нат.) и 54,3 (прогр) ОИП 97,5 (нат) и 44,2 (прогр.), ОИБ 82,2 (нат.) и 82, 1 (прогр.),ОИЗФ 89,2 (нат.) и 83,3 (прогр. ) .

Таким образом, у больной было выявлено снижение опсонизирующей активности лаважной жидкости B отношении фагоцитарной активности (ОИФА) и сыворотки крови в отношении фагоцитарной активности (ОИФЛ в прогретой пробе), завершенности фагоцитоэа (ОИЗФ в прогретой пробе). Скрытый дефицит опсонизирующих факторов сыворотки в данном случае выявлен при прогревании исследуемой сыворотки. Такие результаты расценены как признак активности процесса. Больной была назначена кортикостероид- . ная терапия, по окончании курса которой показатели опсонизирующей активности нормализовались: в лаважной жидкости ОИФА 71,8 (нат,) и 657. (прогр,) в сыворотке крови ОИФЛ 787 (прогр.) и ОИЗФ 94,7Х (прогр.). .Самочувствие больной и ее состояние улучшились, процесс перешел в неактивную форму.

Формула изобретения

Способ определения опсонизирующей активности биологической жидкости путем инкубации ее с фагоцитами донора и с тест-культурой микроорга-, низмов H сопоставления фагоцитарных показателей с контрольными, о т л ич а ю шийся тем, что, с целью повышения чувствительности способа за счет количественной оценки процесса внутриклеточного переваривания, в качестве контрольной используют смесь сывороток крови здоровых доноров, дополнительно исследуют

I пробу инактивированной путем прогревания испытуемой жидкостью, инкубацию проб проводят в течение 120+5 мин, при этом через 30 1 мин от начала инкубации в пробах определяют опсонические индексы фагоцитарной активнос- . ти и поглощения тест-микроорганизмов, а после инкубации — опсонические индексы бактерицидности и завершенности фагоцитоза и по уровню полученных значений определяют опсоиизирующую активность биологической жидкости.